Ex vivo Live-Imaging af Single celledelinger i Mouse neuroepithelium
Summary
Her udvikler vi de nødvendige redskaber til<em> Ex vivo</em> Levende billeddannelse til at spore enkelte celledelinger i muse E8.5 neuroepithelium
Abstract
Vi udviklede et system, der integrerer levende billeder af fluorescerende markører og dyrkning skiver af embryonale muse neuroepithelium. Vi tog fordel af eksisterende muselinjer til genetisk celleafstamning sporing: a tamoxifen-inducerbar Cre linje og en Cre reporter linje udtrykker DsRed upon Cre-medieret rekombination. Ved hjælp af et relativt lavt niveau af tamoxifen, var vi i stand til at inducere rekombination i et lille antal celler, tillader os at følge individuelle celledelinger. Desuden har vi observeret transkriptionel respons på Sonic Hedgehog (Shh) signalering ved hjælp af en Olig2-eGFP transgene linje 1-3, og vi overvåget dannelsen af cilier ved at inficere den kultiverede skive med virus, der udtrykker cilia markør, Sstr3-GFP 4.. For at billedet neuroepithelium, vi høstede embryoner på E8.5, isoleret neuralrøret, monteret den neurale skive i ordentlig dyrkningsbetingelser i imaging kammeret og udførte time-lapse konfokal billedbehandling. Vores exvivo billeddannelse metode gør det muligt at spore en enkelt celledelinger at vurdere den relative timing af primær cilier dannelse og Shh respons i et fysiologisk relevant måde. Denne metode kan let tilpasses ved hjælp distinkte fluorescerende markører og giver marken de redskaber til at overvåge celle adfærd in situ og i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores ex vivo system gør det muligt for os at direkte iagttage enkelt celledelinger under udviklingen neuroepithelium i realtid. Som et eksempel har vi undersøgt celledelinger i muse embryonale neuralrøret og overvåges enten cilium dannelse eller Shh respons. Vi bekræftede vores imaging resultater (n = 24) var i overensstemmelse med resultaterne fra faste sektioner (n = 178) indikerer vores teknik giver fysiologisk relevante data.
Vor teknik bygger på Cre ind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsprojekt blev støttet af et arra Supplement, 5 R01 NS056380. Yderligere støtte blev ydet gennem Viral Vector Core og Microscopy Core af Emory Neuroscience NINDS Core Facilities tilskud, P30NS055077. Vi takker Emory transgene mus og Gene Targeting Core for at udlede musen linje fra GENSAT, Greg Pazour for den stabile SSTR3-GFP IMCD3 cellelinje, og Bradley Yoder for Sstr3-GFP lentivirusoprindelse konstruere. Monoklonale antistoffer blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank, udviklet i regi af NICHD, og vedligeholdes af The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA 52.242. Alle dyreforsøg blev godkendt af IACUC og biosikkerhed udvalget på Emory University.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
