Här utvecklar vi de verktyg som behövs för<em> Ex vivo</em> Bildproduktion att spåra enskilda celldelningar i musen E8.5 neuroepitelet
Vi utvecklade ett system som integrerar live-avbildning av fluorescerande markörer och skivor odling av embryonala mus neuroepithelium. Vi drog fördel av befintliga muslinjer för genetisk cellsläktträd spåra: a tamoxifen-inducerbar Cre linje och en Cre reporter som uttrycker DsRed på Cre-medierad rekombination. Genom att använda en relativt låg nivå av tamoxifen, kunde vi inducera rekombination i ett litet antal celler, som tillåter oss att följa individuella celldelningar. Dessutom observerade vi transkriptionell svar på Sonic Hedgehog (Shh) signalering med en OLIG2-eGFP transgen linje 1-3 och vi övervakade bildandet av flimmerhår genom att infektera odlade skiva med virus som uttrycker flimmerhåren markör, Sstr3-GFP 4. För att bilden av neuroepitelet, vi skördade embryon vid E8.5, isolerat neuralrörsdefekter, monterade den neurala skiva i lämpliga odlingsbetingelser till avbildning kammaren och utfört tidsförlopp konfokala avbildning. Vår exvivo realtidsundersökning metod ger oss möjlighet att spåra enskilda celldelningar att bedöma den relativa tidpunkten för primär cilia bildning och Shh svar i en fysiologiskt relevant sätt. Denna metod kan lätt anpassas med olika fluorescerande markörer och ger fältet de verktyg med vilka för att övervaka cellens beteende in situ och i realtid.
Vårt ex vivo-system ger oss möjlighet att direkt observera enstaka celldelningar i utvecklingsländerna neuroepitelet i realtid. Som ett exempel har vi undersökt celldelningar i musen embryonala neuralrörsdefekter och övervakas antingen cilium formation eller Shh svar. Vi bekräftade vårt bildbehandling resultat (n = 24) var i överensstämmelse med resultaten från fasta sektioner (n = 178) som anger vår teknik ger fysiologiskt relevanta data.
Vår teknik b…
The authors have nothing to disclose.
Detta forskningsprojekt stöddes av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ytterligare stöd gavs genom viral vektor Kärna och Mikroskopi Kärna av Emory Neuroscience NINDS Core Facilities bidrag, P30NS055077. Vi tackar Emory transgen mus och genmålinriktning Kärna för härledning musen linje från GENSAT, Greg Pazour för stabila SSTR3-GFP IMCD3 cellinje, och Bradley Yoder för Sstr3-GFP lentiviral konstruera. Monoklonala antikroppar erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, utvecklades under ledning av NICHDEN och underhålls av University of Iowa, Institutionen för Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alla animaliska förfaranden godkändes av IACUC och Biosäkerhetskommittén vid Emory University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffer | Lab made | ||
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
Hoechst | Fisher | AC22989 | |
TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |