Summary

Ex vivo Live avbildning av Single celldelningar i Mouse neuroepitel

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

Här utvecklar vi de verktyg som behövs för<em> Ex vivo</em> Bildproduktion att spåra enskilda celldelningar i musen E8.5 neuroepitelet

Abstract

Vi utvecklade ett system som integrerar live-avbildning av fluorescerande markörer och skivor odling av embryonala mus neuroepithelium. Vi drog fördel av befintliga muslinjer för genetisk cellsläktträd spåra: a tamoxifen-inducerbar Cre linje och en Cre reporter som uttrycker DsRed på Cre-medierad rekombination. Genom att använda en relativt låg nivå av tamoxifen, kunde vi inducera rekombination i ett litet antal celler, som tillåter oss att följa individuella celldelningar. Dessutom observerade vi transkriptionell svar på Sonic Hedgehog (Shh) signalering med en OLIG2-eGFP transgen linje 1-3 och vi övervakade bildandet av flimmerhår genom att infektera odlade skiva med virus som uttrycker flimmerhåren markör, Sstr3-GFP 4. För att bilden av neuroepitelet, vi skördade embryon vid E8.5, isolerat neuralrörsdefekter, monterade den neurala skiva i lämpliga odlingsbetingelser till avbildning kammaren och utfört tidsförlopp konfokala avbildning. Vår exvivo realtidsundersökning metod ger oss möjlighet att spåra enskilda celldelningar att bedöma den relativa tidpunkten för primär cilia bildning och Shh svar i en fysiologiskt relevant sätt. Denna metod kan lätt anpassas med olika fluorescerande markörer och ger fältet de verktyg med vilka för att övervaka cellens beteende in situ och i realtid.

Protocol

Vuxna möss avlivas genom mekanisk cervikal dislokation. Alla animaliska förfaranden godkändes av IACUC och Biosäkerhetskommittén vid Emory University. Ett. Embryo Generation Cross tamoxifen-inducerbara Cre linje, CAGGCreER och dsRedCre reporter linje (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figur 1) 5,6. För övervakning av relativa timingen för Shh respons i dottercellerna, cross CAGGCreER och DsRed linje med OLIG2-EGFP BAC transgena möss (Tg (OLIG2…

Representative Results

Här har vi utfört ex vivo levande avbildning av enstaka celldelningar inom E8.5 musen neuroepitelet. Att märka enskilda celler, inducerade vi Crerekombinas i en delmängd av celler som innehåller ett Cre reporter linje som uttryckte DsRed vid rekombination 5,6 (Figur 3A). Således, 48 timmar senare kunde vi konstatera enstaka celldelningar under ex vivo imaging (figur 4A-D). Samtidigt, övervakade vi när de märkta cellerna blev Shh-lyhörda genom att t…

Discussion

Vårt ex vivo-system ger oss möjlighet att direkt observera enstaka celldelningar i utvecklingsländerna neuroepitelet i realtid. Som ett exempel har vi undersökt celldelningar i musen embryonala neuralrörsdefekter och övervakas antingen cilium formation eller Shh svar. Vi bekräftade vårt bildbehandling resultat (n = 24) var i överensstämmelse med resultaten från fasta sektioner (n = 178) som anger vår teknik ger fysiologiskt relevanta data.

Vår teknik b…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta forskningsprojekt stöddes av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ytterligare stöd gavs genom viral vektor Kärna och Mikroskopi Kärna av Emory Neuroscience NINDS Core Facilities bidrag, P30NS055077. Vi tackar Emory transgen mus och genmålinriktning Kärna för härledning musen linje från GENSAT, Greg Pazour för stabila SSTR3-GFP IMCD3 cellinje, och Bradley Yoder för Sstr3-GFP lentiviral konstruera. Monoklonala antikroppar erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, utvecklades under ledning av NICHDEN och underhålls av University of Iowa, Institutionen för Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alla animaliska förfaranden godkändes av IACUC och Biosäkerhetskommittén vid Emory University.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J Jackson Laboratory 005438  
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd MMRRC, 010555-UCD  
CAGGCreER Jackson Laboratory 003724  
Tamoxifen Sigma T5648  
DMEM/F12 (1:1) GIBCO 21041-025  
Newborn calf serum Lonza 14-416F  
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122  
Rat Serum SD male Harlan Bioproducts 4520  
1M Hepes BioWhittaker 17-737E  
L-Glutamine GIBCO 21041-025  
Light mineral oil Sigma M8410  
Sstr3-GFP lentivirus Emory Viral Core    
Micro-knife, size 0.025 mm Electron Microscopy Sciences 62091  
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish MatTek P35GC-0-10-C  
100% petroleum jelly Kroger FL9958c  
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope Nikon    
NIS Elements software Nikon    
Imaris 3D software Bitplane AG Imaris 7.2.3  
OCT Tissue-Tek 4583  
Cryostat Leica CM1850  
Heat-inactivated sheep serum Invitrogen 16210-072  
Triton X-100 Fisher Scientific BP151  
Parafolmaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffer Lab made    
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) Chromotek 110411  
Rabbit anti-Arl13b serum NeuroMab    
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 NeuroMab    
Rabbit anti-Olig2 Chemicon AB9610  
Mouse monoclonals Pax6 Developmental Hybridoma Bank Pax6  
Mouse monoclonalsShh Developmental Hybridoma Bank 5E1  
Mouse monoclonals Nkx2.2 Developmental Hybridoma Bank 74.5A5  
Rabbit polyclonal Ki67 Abcam AB15580  
Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029  
Alexa Fluor 568 Molecular Probes A11031  
Alexa Fluor 350 Molecular Probes A11046  
Hoechst Fisher AC22989  
TO-PRO-3 Invitrogen T3605  
ProLong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36934  

Referências

  1. Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
  2. Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
  3. Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
  4. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  5. Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
  6. Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
  7. Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  8. Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
  9. Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  10. Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
  11. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
check_url/pt/4439?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (74), e4439, doi:10.3791/4439 (2013).

View Video