Hoewel niet getoond in de video, werden ratten eerst gegeven een overdosis van 300 mg / kg pentobarbital, waardoor anesthesie in minder dan 3 minuten en vervolgens gedood door onthoofding. Hun hersenen waren daarna snel, maar zorgvuldig verwijderd uit de schedel en gekoeld in ijs-koude zoutoplossing gedurende 5 minuten. Het is belangrijk de hersenen afkoelen voor deze tijd voor het ontleden van de MAV zodat de MAV kan worden gescheiden van het oppervlak van de cortex (boven laag I). De hersenen werden dan geplaatst in de bodem van een glazen petrischaal rusten op ijs dat vol (1 cm diep) ijskoude zoutoplossing of 0,1 M natriumfosfaat-gebufferde zoutoplossing pH = 7,4. Alle dissectie gebeurt met de hersenen voor het grootste deel ondergedompeld in zoutoplossing. 1. Verwijdering van de Pijnappelklier Plaats de hersenen rugzijde (ten opzichte van de bodem van de petrischaal). De pijnappelklier is gelegen aan de meest caudale ventrale gebied tussen de twee hersenhelften gewoon rostraal thij cerebellum (pijnappelklier uitsparing), en net onder of aan het oppervlak van de hersenvliezen de colliculi. Verwijder de pijnappelklier eerste gebruik van twee kleine gebogen tip pincet. Het is roze van kleur, zoals de cortex, maar wordt vaak omgeven met resten van bloed en bloedvaten restpost uit de hersenen te verwijderen. 2. Verwijdering van de MAV Flip de hersenen dan "ondersteboven" en scheiden de vertebrale slagader, kleinere slagaders en hersenvliezen die de pons van de hersenvliezen en bloedvaten van de voorhersenen. Verwijdering van de voorhersenen MAV wordt dan gestart. Het is belangrijk om ventraal starten in de dissectie proces. De grote grote assen van de cirkel van Willis, midden cerebrale slagaders (MCA) en anterior slagaders zijn de sterkste en dienen als "scaffolding" waardoor de kleinere oppervlakkige arteriën en arteriolen van de pial membraan kan dan worden verwijderd uit de cortex en de rest van het hersenvlies. Zie toetsing door Scremin 7 voor merts visuele representaties en de details van de cerebrale oppervlak vaatstelsel. Te beginnen met een van beide halfrond, gebruik maken van de kleine gebogen uiteinde een tang om de posterior communiceren slagader juist achter het interne carotis moment verbreken. Zo scheidt de meer anterior en posterior arteriële bomen van de voorhersenen. Doe hetzelfde voor de contralaterale hemisfeer. Vastgrijpen van de MCA en de voorste slagader met de forceps, trek in een anterior-dorsaal zodat de MAV voor de ventrale voorste cortex (piriformis, olfactorische knobbel) omhoog over en rond de reukkanaal. Dit verwijdert een groot deel van de MAV die de anterieure cortex (cingulated en orbitale). Draai de hersenen op 45 tot 90 ° hoek met de petrischaal. De laterale, meer anterieure regio's van de MAV rond de laterale corticale gebieden (granulaire insulaire, secundaire somatosensorische en auditieve cortex) kunnen worden bevrijd van de cortex door het vastgrijpen van de MCA en de bijbehorende Arters en zachtjes te trekken dorsaal langs de cortex. Indien nodig kunnen de uiteinden van de forceps worden gebruikt voor het optillen en de grote slagaders bevrijden van de cortex bij dissectie. Verwijder nu de meer posterieure laterale regio's van de MAV. (Let op, het beste van een halfrond naar de andere tijdens dit oogstproces dat de MAV koud blijft en gehydrateerd. Ook wanneer weerstand in het bevrijden van de MAV van de cortex wordt aangetroffen op een halfrond schakelaar in de contralaterale hemisfeer tijdelijk en dan later terug te gaan naar de oorspronkelijke halfrond.) Om de dorsale de MAV rondom de primaire somatosensorische cortex motor verwijderen en zet de hersenen rugzijde (ten opzichte van de bodem van de petrischaal). Eindelijk bevrijden van de MAV hersenen, met de uiteinden van de forceps langs de sagittale sinus. Dit gedeelte van de geoogste MAV tijdelijk worden bewaard in ijskoude zoutoplossing tot testen en analyse of ingevroren voor latere verwerking. Vaakde MAV dat de meest posterieure / caudale gebieden van de cortex (entorhinale, visuele en auditieve cortex meest caudale) blijft aan de cortex. De verwijdering wordt later weergegeven in de video wanneer de MAV tussen de retrosplenial cortex en bovenop de colliculi worden ontleed. 3. Verwijdering van de Choroid Plexus Plaats de hersenen rugzijde en houd deze met de grotere forceps Druk de kleinere forceps beneden door de middellijn tussen de hemisferen en de uiteinden gebruik te prikken door de cortex en corpus callosum (≈ -3,3 mm van bregma) in de bovenkant van de middellijn van de hippocampus. Gebruik de tang om de cortex weg te trekken met callosum van de dorsale hippocampus en septum, het blootstellen van het grootste deel van de laterale ventrikel. De choroidea plexus kunnen worden gelokaliseerd en geïdentificeerd door de golvende rode lijn afbakenen van de belangrijkste slagader die de lengte loopt. Gebruik de twee uiteinden van de forceps op de zijwanden van de derde ven wrikkentricle en vergroten op de meest caudale einde (≈ -4,3 mm van bregma 8). Met behulp van de kleine tang, trek dit einde van het vaatvlies plexus gratis. Ga dan naar de zeer anterieure gebied tussen het septum en caudate / putamen (meest rostrale mate ≈ +1.6 mm van bregma) en met de tang te vergroten dit deel van het ventrikel en trek de choroidea plexus gratis. Voer dezelfde procedure uit op de contralaterale hemisfeer naar de tweede resterende choroidea plexus te verkrijgen. Ook dit weefsel kan tijdelijk worden bewaard in ijskoude zoutoplossing tot testen en analyse of ingevroren voor latere verwerking. 4. Het verwijderen van de resterende MAV in de 3 e ventrikel bovenop de Thalamus en de Colliculi evenals die op de meer Caudal Regio's van de Cortex waaronder Retrosplenial, auditieve en visuele cortex Verwijder het gehele hippocampus van beide hersenhelften het blootstellen van de MAV in de thalamus en colliculi. De verwijdering vandit deel van de MAV veel minder moeilijk dan het verwijderen van MAV de cortex. Trek dit deel van de MAV vrij door het grijpen van de grotere bloedvaten bovenop het voorste deel van de thalamus en zachtjes te trekken caudaal. Deze vasculatuur is verbonden met het netwerk supra collicular en afleveren van bloed aan de dorsale hippocampus en thalamus dorsale netwerk. Trek het weg caudaal en geleidelijk gratis de supracollicular netwerk tot het bereiken van de laatste delen van de caudale arteriële cirkel vaatstelsel. Op dit punt, moet meer zorg worden genomen om eventuele resterende achterste ventrale MAV te verwijderen op het oppervlak van de granulaire retrosplenial, primaire auditieve en visuele cortex. Zoals met de andere sectie van MAV voor de voorste meer delen van de cortex, kan dit weefsel tijdelijk worden bewaard in ijskoude zoutoplossing tot testen en analyse of ingevroren voor latere verwerking. Elke resterende achterste ventrale MAV geoogst met deze tweede MAV deel moet worden verwijderd eend aan de eerste ontleed MAV sectie betreffende de cortex als ze afzonderlijk worden geanalyseerd. 5. Representatieve resultaten Wanneer de dissectie correct wordt uitgevoerd, dient de resulterende MAV weefsels in twee intacte entiteiten gewicht ongeveer 35 tot 45 mg totaal. De aanvankelijk ontleed MAV rond het grootste deel van de cortex moet wegen ongeveer 25 mg en de MAV die de thalamus, moet colliculi en occipitale cortex wegen ongeveer 15 mg. Het moet rozig in kleur van de resterende bloed in het vaatstelsel. De bilaterale choroid plexus vergaard in twee intacte weefsel monsters met elk een gewicht van 1 tot 2 mg. Hoewel overtollige water wordt verwijderd uit de MAV vóór opslag of verwerking met tissuepapier zoals in lens reinigen van weefsel te voorkomen is het niet verstandig om overtollig water uit de gedissecteerde choroid plexus. Figuur 1 werd gegenereerd voor het vergelijken van expressie profil es in drie regio's (striatum, pariëtale cortex en MAV) onder controle omstandigheden met behulp van Agilent-014879 Hele Rat Genome 4x44K 60mer oligonucleotide arrays (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Toetreding # GPL7294, GSE23093 en GSE29733 die aanwezig zijn op de NCBI GEO repository). De twee plots in de figuur picturaal tonen de uitdrukking in 1) het striatum opzichte van de pariëtale cortex en 2) de MAV opzichte van de pariëtale cortex. Het is duidelijk dat het striatum en pariëtale cortex veel meer verwant aan elkaar dan de MAV. De gegevens vergelijken van de choroidea plexus met de MAV zal worden gepresenteerd in een toekomstige publicatie. Het is echter waarschijnlijk dat de expressieprofielen in de MAV en choroidea plexus meer verwant aan elkaar dan zij de striatum en pariëtale cortex. Figuur 2 toont de differentiële genexpressie reactie hyperthermie (EIH) versus Amph in vergelijking MAV te controleren en elkaar. content "> De genexpressie van meer dan 11.000 genen officiële NCBI gen symbolen MAV controledieren werd vergeleken met dat van het striatum en pariëtale cortex. dan 2000 van deze genen hebben een 2,5-voudige of meer verschillende expressie in de MAV Vergeleken met de twee neuronale-rijke weefsels en 550 genen hadden een 10 maal groter verschil in expressie. Iets meer dan 40% (253) van deze genen waren met een verminderde expressie van 10-voudig of meer MAV en had betrekking op neuronale functie. Er waren 343 genen met meer dan 10-voudig of meer expressie in vergelijking met MAV pariëtale cortex en striatum. Deze lijst van genen werd gebruikt als uitgangspunt waarmee genen bepalen met een zeer hoog verrijkt in de MAV. Table 1 worden de genen met meer dan 15-voudig expressie in vergelijking met MAV pariëtale cortex en striatum en categoriseert ze met betrekking tot de functie. Veel van deze genen gerelateerd aan het vasculaire systeem en / of het immuunsysteem. Deze tOORTEN genen worden verrijkt ongeveer 5 – tot 10 – voudig tot vanwege de toegenomen vasculatuur zelf en bloed daarin. Maar zelfs voor genen met bekende algemene vasculaire functies, een toename van meer dan 15-voudige verrijking in MAV geeft. Er waren ook aantal genen met grote veelvoudveranderingen die waren: 1) extracellulaire matrixeiwitten (niet specifiek betrekking op vasculatuur), 2) solute transporters en 3) lipide en retinoïnezuur metabolisme. Als goed, weinig groei en differentiatie gen of transcriptiefactoren gevonden. Figuur 1. Vergelijking van de genexpressie in MAV met pariëtale cortex en striatum. Volcano perceel het vergelijken van de genexpressie niveaus van de pariëtale cortex en striatum (boven plot) en de pariëtale cortex en MAV (onderste grafiek). De rode symbolen geven de genen die significant verschillend between regio's p <0,05 en een 1,5-voudig of meer differentiële expressie regio. De zwarte symbolen vertegenwoordigen genen die niet wezenlijk verschillen tussen regio's (p> 0,05) en minder dan 1,5-voudig verschil in expressie. De roze symbolen genen met minder dan 1,5-voudig verschil in expressie maar statistisch significant verschillend bij p <0,05. De gele symbolen genen te identificeren die een 1,5-voudige of meer expressie hebben, maar deze verandering is niet statistisch significant bij p <0,05. Afkortingen Amph amfetamine EIH milieu-geïnduceerde hyperthermie MAV meninges en bijbehorende cerebrale bloedvaten Norm normotherme controleert Figuur 2. Effecten van hyperthermie en amfetamine op genexpressie in MAV. Volcano percelen te vergelijkengenexpressieniveaus in de MAV na zoutoplossing, EIH of Amph op 3 uur tijdstip. De rode symbolen geven de genen die geacht worden significant verschillend terwijl de zwarte stippen / cirkels genen die niet wezenlijk verschillen tussen regio's. Bijkomende statistische analyse werd gebruikt om te controleren welke uitdrukking verschillen tussen controle en behandeling in feite statistisch significant. MAV Expression Brain Expression NCBI Gene Symbolen Weefselspecificiteit of gemeld Functie (s) > 50-voudig Anxa2 een, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl a, Lect1, LepR, Lum, Myh11, OGN, Tagln, Thbs2, Tnnt2 Vasculatuur & Heart > 50-voudig Ccl19, CD74 een, Defb1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da Immuunsysteem > 50-voudig ADH1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 Retinoïnezuur & Lipid Processing > 50-voudig CDH1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, eMP3, Gpc3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Extracellulaire matrix en cel-cel verbindingen > 50-voudig Aqp1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion & opgeloste Homeostase > 50-voudig Alx3, Cdkn1c, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, sFRP1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Ontwikkeling & Transcriptie Verordening > 50-voudig Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Onbekend & Diversen 30 tot 50-voudige </td> Anxa1 een, Angpt2, C6 een, GJB2, Ptgis, Thbd, Timp1 Vasculatuur & Heart 30 tot 50-voudige Casp12, CCL2, CCR1, CD14, CXCL10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 Immuunsysteem 30 tot 50-voudige Col6a3, Cpxm1, Efemp1, FMOD, MGP, Nid2 Extracellulaire matrix en cel-cel verbindingen 30 tot 50-voudige Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion & opgeloste homeostase 30 tot 50-voudige Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 Retinoïnezuur & Lipid Processing 30 tot 50-voudige BMP6, Casp12, DAB2 Folr1, Igf2, MSX1, Tbx18, Twist1, Wnt5b Ontwikkeling & Transcriptie Verordening 30 tot 50-voudige Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Onbekend & Diversen 15 tot 30 voudig Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf een, Cnn1, Cox8h, Ctsk, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, Pros1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, Vtn Vasculatuur & Heart 15 tot 30 voudig Ada een, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, Ctsc, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Immuunsysteem 15 tot 30 voudig Adamtsl4, COL1A1, Crb3, Dpt, Egfl3, Fbn1, Fbln1, Fbln5, Fn1, Itgb4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, Ppic, Serpinh1, TIMP3 Extracellulaire matrix en cel-cel verbindingen 15 tot 30 voudig Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion & opgeloste homeostase 15 tot 30 voudig Agpat2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, Rbp1, RBP4 Retinoïnezuur & Lipid Processing 15 tot 30 voudig ATF3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 Ontwikkeling & Transcriptie Verordening 15 tot 30 voudig Adamts12, Adamtsl3, C1R, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, Gnmt, Gprc5c, HSPB1, Klc3, Krt18, Krt19, MdK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, NET1, Pdlim2, Phactr2, Plp2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 Onbekend & Diversen * Genen in de tabel moeten beide meer dan 15-voudig bovenstaande formule in het striatum en in Parietal cortex en 5-voudig boven de achtergrond niveaus. De laagste van de twee ratio's (MAV / striatum of MAV / pariëtale cortex) voor elk gen werd gebruikt voor het groeperen. een Genen worden gevonden in endotheelcellen maar waarschijnlijk ook een belangrijke rol spelen bij het ​​bewerkstelligen immuunresponsen. Tabel 1. Genen met een 15-voudige of meer * verhoogde expressie in vergelijking met MAV striatum en pariëtale cortex.