CRISPR / CAS系统介导的适应性免疫中的细菌和古细菌。提出了许多CA蛋白作为核糖核酸内切酶作用于不同长度的crRNA前体。在这里,我们说明了三种不同的方法,CAS核酸内切酶活性的生化分析以产生前crRNA的底物。
病毒和它们的原核宿主的相互作用塑造细菌和古细菌生活的演变。原核生物开发了多种策略逃避病毒攻击,包括限制修饰,流产感染和CRISPR / CAS系统。这些发现在许多细菌和古细菌的适应性免疫系统组成的 C上光ŕegularly,我 nterspaced 短p alindromicŕEPEAT(CRISPR)序列和的 C RISPR数sociated(CAS)的基因(图1)1-3。 CAS蛋白质和重复套不同的定义至少有三大不同类型的CRISPR / CAS系统4。通用的蛋白质CAS1,CAS2,提出要参与病毒DNA的摄取将生成一个新的间隔件元件之间延伸CRISPR簇5的5'末端的两个重复。整个群集被转录到的前体crRNA的含有所有的隔板和重复序列,并随后通过酶处理成更小的crRNAs 6-8多样化Cas6系列。这些crRNAs组成的间隔区序列的5'末端(8个核苷酸)和3'末端标记的重复序列9来自两侧。一个重复感染的病毒现在被封锁的蛋白复合物(级联)作为新的crRNA会被定向到病毒的DNA,将其识别为通过互补碱基10。最后,CRISPR / CAS 1型系统,核酸CAS3会破坏检测到入侵者的DNA 11,12。
这些过程定义CRISPR / CAS的适应性免疫系统的原核生物,并开了一个迷人的研究领域所涉及的CAS蛋白的研究。许多CA蛋白的功能仍然是难以捉摸和明显的多样性的CRISPR / CAS系统的原因仍然被照亮。通过详细的计算分析,大多数CA蛋白的潜在活动进行了预测。一个主要部分的CAS蛋白或建议作为核酸内切酶4。
这里,我们提出的方法,产生crRNAs和前体的cRNA CAS号核糖核酸内切酶的研究。不同的核酸内切酶的测定需要,可以直接合成的RNA寡核苷酸或不再crRNA和预crRNA的序列,该序列通过在体外 T7 RNA聚合酶转录运行产生的任一短的重复序列。这种方法允许将用于生成内部标记的核酸内切酶基板和的合成或突变crRNAs的创建的放射性核苷酸。 cas6核酸内切酶活性是利用成熟预crRNAs成crRNAs与5'-hydr氧基和2',3'-环磷酸末端。
所提出的方法使产生的CAS核酸内切酶底物不同尺寸范围不同序列设计的自由。用于产生合成的RNA寡核苷酸基板的最直接的方法是有限的短RNA的设计,由于增加了成本和技术的局限性,在创建更长的RNA的低聚物。自定义的RNA合成的实际和经济的最大在于虽然成功RNA合成已被报道用于超过100个核苷酸长度的未修饰RNA的低聚物,在40个核苷酸以下。然而,任何给定的序列可以合成和有针对性地引入经修饰的核苷酸(如脱氧核糖核苷酸),可以被用来分析详细的裂解位点。停止前的cRNA应通过体外转录产生。
含有T7 RNA聚合酶启动子的寡核苷酸退火允许生产的中间长度预crRN为。例行和经济上的合成的DNA寡核苷酸的最大长度仅仅是150个碱基以上,代表最大的合成预crRNAs通过此方法。几个退火,形成粘性末端的DNA寡核苷酸对相互的组装可以延长这个最大的长度,但必须在克隆的构造越来越多的挑战。这种方法的主要优点是生成crRNA预构造(及因此CAS基板)核酸内切酶的能力与任何所需的顺序。这允许测试合成crRNA设计。
最后,可以得到更大的预crRNAs从PCR amplificates整个基因组的CRISPR元素或其馏分。改建的体外转录的模板质粒可以通过位点定向诱变引入用于生成预crRNA变种。这些结构可以被用来分析全球信使核糖核酸图案内的整个前crRNA。
通过T7 RNA聚合酶体外转录的未修饰RNA,用于生产的先驱工作的基础上转移RNA 14,雀麦花叶病毒RNA 15。 T7 RNA聚合酶启动子的共识由识别域(-17至-5)和一个起始域(-4至6)在一个基本的鸟苷1 16的转录起始。设备的持仓+1的下游可以改变,它允许为几乎任何所需的RNA序列的转录。所提出的方法在体外决胜转录模板用于产生允许的完整的预crRNAs的匹配的基因组的的CRISPR区域的或合成的的预crRNA变种在体外合成。转录产生的具有5'-末端三磷酸本除非浸过水的GMP的转录反应,得到5'单磷酸末端14。这种总站的需要,如果是被标记的成绩单用T4多核苷酸激酶和γ-[32 P]-ATP。的Cas6和Cas6样酶的裂解活性生成的crRNA包含5'-羟基和2',3'-环磷酸末端。然后,这些RNA进行分析,以识别的级联复杂的。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢珍妮特Schermuly编制重组的T7 RNA聚合酶和诺曼Ebelt的协助编制图1。这项工作是由德意志研究联合会(DFG FOR1680)和马普学会的资金。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |