Summary

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Published: November 29, 2012
doi:

Summary

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

Abstract

הבנת מאפייני biophysical והארגון תפקודי של תאי עצב בודדים וכיצד הם מעבדים מידע הוא יסוד להבנה כיצד המוח עובד. תפקידו העיקרי של כל תא עצב הוא לעבד אותות חשמליים, בדרך כלל ממקורות מרובים. תכונות חשמליות של תהליכים עצביים הן מורכבות מאוד, דינמיות, ובמקרה הכללי, אי אפשר לחזות בהעדר מדידות מפורטות. כדי להשיג מדידה אחת כזו היית, באופן אידיאלי, רוצה להיות מסוגל לפקח, במספר רבים של אתרים, אירועי subthreshold כשהם נוסעים מאתרים של מקור בתהליכים עצביים וsummate במקומות מסוימים כדי להשפיע על ייזום פוטנציאל פעולה. מטרה זו לא הושגה בכל תא עצב בשל מגבלות טכניות של מדידות שמעסיקות אלקטרודות. כדי להתגבר על חסרון זה, רצוי מאוד כדי להשלים את גישת תיקון-אלקטרודה עם שיטות הדמיה המאפשרות recordin המקביל הנרחבGS מכל חלקי תא עצב. כאן, אנו מתארים טכניקה כזו – הקלטה אופטית של הארעיים פוטנציאליים קרום עם צבעים אורגניים מתח רגישים (V-m הדמיה) – מאופיינים בתת האלפית השני ורזולוצית המשנה מיקרומטר. השיטה שלנו מבוססת על עבודתו החלוצית בבדיקות מתח רגישות מולקולריות 2. היבטים רבים של הטכנולוגיה הראשונית שופרו ברציפות במשך כמה עשורים 3, 5, 11. בנוסף, עבודה קודמת תעדה שני מאפיינים מהותיים של V-מ 'הדמיה. ראשית, אותות קרינה הם ליניארי יחסיים לפוטנציאל קרום מעל הטווח הפיזיולוגי כל (-100 mV ל100 mV; 10, 14, 16). שנית, הנוירונים טעינה עם לצבוע מתח הרגיש משמש כאן (JPW 3028) אין לו השפעות תרופתיות לזיהוי. נרשמה רחבה של ספייק במהלך טעינת צבע היא הפיכה לגמרי 4, 7. בנוסף, עדות ניסויית מראה כי ניתן להשיגמספר משמעותי (עד מאה) של הקלטות לפני כל השפעות גילוי phototoxic 4, 6, 12, 13. כרגע, אנחנו מנצלים את הבהירות והיציבות המעולות של מקור אור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי למקסם את הרגישות של טכניקת V-מ 'ההדמיה. הרגישות הנוכחית מאפשרת הקלטות אופטיות אתרים מרובות של הארעיים V מ 'מכל חלקי הנוירון, כולל אקסונים וטחונות האקסון, סניפים הדנדריטים מסופים, וקוצים הדנדריטים בודדים. המידע שנרכש על אינטראקציות אותות ניתן לנתח כמותית כמו גם ישירות דמיין בצורה של סרט.

Protocol

1. התקנת ציוד שלב 1.1. התקנת הדמיה המפתח להקלטת אותות צבע רגיש מתח הוא עיצוב התקנה מתאימה. אנו משתמשים במיקרוסקופ זקוף (BX51WI אולימפוס או Zeiss AxioExaminer) מצויד בשלוש מצלמות. ההתקנה נועדה לנוירונים מאיר בו…

Representative Results

מיקרוסקופיה confocal המוצלחת צריכה לאפשר זיהוי ברור של תהליכים עצביים שלמים שהם קרובים אל פני השטח של הפרוסה וממוקמים במישור אחד של פוקוס. הבחירה של תאי עצב המתאימים להדמית מתח לפני הטעינה לצבוע מתח רגיש היא קריטית. דוגמה לתמונות confocal של נוירונים פירמידליים L5 מבטאים EGFP ?…

Discussion

מאמר זה מתאר שיטת הקלטה לצבוע מתח רגישה לניטור פעילות חשמלית של תאי עצב בודד ב- מיקרומטר משנה ורזולוצית המשנה האלפית השנייה חלל ובזמן. עירור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי (לגבי גודל אות) שפר את הרגישות של הקלטה בפקטור של ~ 50 על גישות קודמות. הרגישות הנוכחית מאפשרת ניטור …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו הקנוט Holthoff, ארתור Konnerth ומרק Canepari שהשתתף בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, כמו גם לסלי מ 'לייב למתן צבעים חביבים. נתמך על ידי מענק NSF IOS-0817969, מענקי NIH NS068407 וM136043 ועל ידי מכון קאוולי למדעי המוח באוניברסיטת ייל.

Materials

Name of the component Company Catalogue number Comments (optional)
Setup components
Upright Microscope Olympus Inc. BX51WI With three camera ports
Motorized Movable Stage Siskiyou MXOPi.2
Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 TILL Photonics 0000-560-11659
Upright Microscope Carl Zeiss, LLC AxioExaminer D1 With three camera ports
Motorized Top Plate Scientifica Limited MMBP
Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer TILL Photonics
Data Acquisition Camera RedShirtImaging LLC NeuroCCD-SM High speed, low read noise
CCD for IR-DIC Dage-MTI IR-1000
Spinning-Disc Confocal Scanner Yokogawa CSU-10
High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner PCO AG PixelFly 1392×1024 pixels
DPSS CW Laser (532 Nm) CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd MLL-III-532 400mW Excitation light source
Multi-Mode Fiber Launcher Siskiyou SM-CFT
Light Guide TILL Photonics 0000-515-11524
Shutter Vincent Associates LS6
Vibration Isolation Table Minus k Technology MK26
Specific reagents
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) Life Technologies D-6923 Voltage sensitive dye
Crym-EGFP Mouse Line GENSAT (MMRRC) STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons

Referências

  1. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  2. Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
  3. Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
  4. Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
  5. Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
  6. Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
  7. Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
  8. Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
  9. Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
  10. Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
  11. Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
  12. Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
  13. Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
  14. Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
  15. Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
  16. Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
  17. Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
check_url/pt/4261?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices. J. Vis. Exp. (69), e4261, doi:10.3791/4261 (2012).

View Video