患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

次のプロトコルは、単一のマイクロデバイスの製造のためのものです。 1。ハロイサイトナノチューブ溶液の調製超音波処理（10〜13 W（RMS））250μLハロイサイトナノチューブの溶液（水で6.6重量％）30秒。一度冷たい水と繰り返し超音波のクールなソリューションを提供します。再び冷却する。 シリンジに超音波処理したソリューションを引く、きれいな微量遠心チューブに0.45μmのシリンジフィルター、およびフィルタソリューションを添付してください。均質性を維持するために、時折渦ソリューションを提供します。 2。ハロイサイトナノチューブとマイクロチューブ内表面のコーティング 50センチメートルマイクロRenathane microtubingの長いセクション（300μmの内径、35.3μLの内部ボリューム）を取得します。対角でチューブの一方の端を切り取り、小さなIDEXアダプタ部分に挿入します。チューブのもう一方の端に3月10日CC 29G注射器の針を挿入します。 マイクロチューブをきれいにするには、チューブの開放端（エンド配置アダプタ付き）70％エタノールにしてチューブを埋めるために注射器に約50μLのエタノールを描画します。 注射器に蒸留水の寛大なボリュームを描画することにより、マイクロチューブのエタノールをすすぐ。 マイクロチューブからシリンジを外します、注射器を空にし、マイクロチューブに再接続します。 水の中のリジン0.02パーセントw / vのポリ-Lの溶液を調製します。マイクロチューブに50μLを描画し、室温（RT）で5分間座ってすることができます。 マイクロチューブに100μLのろ過ナノチューブ溶液を描画し、室温で3分間インキュベートすることができます。 ナノチューブ溶液をリンスするためにチューブを介して100μLの水を描画します。 RTで一晩、水で満たされた、座って被覆したマイクロチューブを許可します。 3。細胞分離用マイクロチューブの調製 1Xダルベッコのリン酸塩の10μg/ mLのタンパク質Gの溶液を調製します（ – 7.2 PBS、pH7.0）で緩衝生理食塩水。マイクロチューブを介して50μLのPBSを描画してからの50μLを描くプロテイン-G溶液と室温で1.5時間インキュベートすることができます。 5μg/ mLのE-セレクチン-IgGとPBSで50μg/ mLの抗体（ほとんどの癌サンプル、抗PSMA前立腺癌サンプルの抗-EpcAM）を含む溶液を調製します。マイクロチューブにE-セレクチンと抗体溶液50μLを描き、室温で2時間インキュベートすることができます。 非特異的な細胞接着は、5％乳タンパク質でブロックされています。 5％（w / v）を、PBS中の乳蛋白質の溶液を調製します。マイクロチューブに50μLの乳蛋白質溶液を描画し、室温で1時間インキュベートすることができます。 チューブに50μLのPBSを描画し、血液やバフィコートサンプルを処理するための準備が整うまで室温で残す。 前の絶縁のためのマイクロチューブを使用して、〜10分、セレクチン分子をアクティブにするのCa 2 +（ "PBS +"）で飽和された50μLのPBSを描画します。 4。細胞分離用サンプルの調製患者からヘパリンに10 mLの血液を描画または取得チューブ。 50 mLの遠心チューブに10 mLの場所をFicoll-Paqueリンパ球分離液。フィコールの上にそっと層10 mlの全血がように血とフィコールを混在させないように。 °C最小限の減速で4℃15分間2000X gで遠心分離します。 新しいチューブにバフィーコート層と場所を削除します。 PBSで洗浄バフィーコート（10分間230x gで遠心し、上清を捨てる）。 静かに1 mLの赤血球溶解バッファーで細胞を再懸濁し、赤血球を溶解する室温で10分間インキュベートする。 10 mLのPBS、穏やかに混合し、10分間230x gで遠心分離を追加します。上清を捨て、ゆっくりと3から4 mLのPBS +でペレットを再懸濁します。 5。細胞単離 IDEXのアダプタを使用して5 mLシリンジに官能チューブの一方の端を取り付けます。 シリンジポンプにシリンジを挿入します。 水没セルサスペンシオに、官能チューブの開放端N。 1から4 ml /時間でチューブを介して細胞懸濁液を処理します。 PBSを含むチューブにチューブの開放端を転送+とチューブから非結合と疎結合した細胞を除去するために0.016 mL / minでシリンジに300μLのPBS +を描画します。 きれいなチューブにチューブの開放端に配置します。マイクロチューブからシリンジを取り外し、Accutaseとプレフィルドシリンジを接続します。そっと埋めるためにマイクロチューブに十分なAccutase（〜50μL）を灌流し、10分間室温でインキュベートすることができます。 プレートよく扱わ組織培養に廃液収集し、マイクロチューブに増殖培地を1 mL（79％RPMI、20％FBS、1％ペニシリンストレプトマイシン）とプレフィルドシリンジと灌流を添付してください。 37℃で培養細胞℃、加湿条件の下で5％CO 2。 6。代表的な結果この手法の目的は、癌患者の血液から生存癌細胞を単離することである。デバイスの成功に必要な検証、いくつかの方法では、文化の中でがん細胞を識別するために存在しています。我々は、無傷の細胞核（図2および3）を識別するためにDAPIに加えて、そのようなEpCAM（上皮細胞接着分子）またはPSMA（前立腺特異的膜抗原）などの上皮部分に対する抗体で培養中の細胞を染色することを選択しました。癌細胞の数は、このテクニックを使用してキャプチャ必ずしも出発試料にCTCの数の関数であり、患者のばらつきが高くなることがあります。 IV期のがんと診断された患者から採取したサンプルを処理する際に、我々は日常的に純度の血液のチューブあたり100〜500癌細胞、> 50％をキャプチャします。直ちに分離後に、汚染白血球の大きい番号が存在する可能性があります。しかし、これらの番号は、最大5日間の培養培地中でのインキュベーション後に枯渇されます。 <stロン>図1。抗体媒介静的接着に続いセレクチンを介した転がりを示すCTCの分離のための官能チューブの模式図。 図2乳癌患者および肺癌患者から採取した血液サンプルからのCTCの分離の代表的なデータです。 EpCAM染色に基づいて積極的にCTCとして識別され、生存細胞の数は、固体のバーや左側の縦軸と捕捉された細胞の総数と比較して、CTCとして同定された細胞の割合に関係で表されているオープンのバーで表され、右側の縦軸上で測定。結果は、文化の中で五日後にされています。 isolati〜5日以降の文化の中で、CTCの独立したドナー（AとB）から図3代表的な顕微鏡写真癌患者の血液サンプルから上に。細胞は、蛍光核（青）を可視化するためにAlexaFluor 488 EpCAM（緑）と4 ',6-ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI）で染色した。