Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti ^1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l'origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia ^2,3. L'importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l'eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento ^3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati ^2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale ^6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l'alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine ​​cardiache nei mammiferi tra ^8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti ^10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca ^{2 +)} contenuti ^12. Nell'ultimo passaggio, l'effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca ^{2 +} transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.