גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. ביולוגיה מולקולרית 1. לבנות עיצוב השתמש בתוכנת מלחין ג'ין לעצב מבנה חלבון ורצפי גנים סינטטיים מהונדסים קודון. השימוש בתוכנת מלחין ג'ין כבר הציע בפירוט במקום אחר 3. להשתמש במודול מציג המערך ולבנות מודול העיצוב להשוות יישור רצף חלבון ולהגדיר מבנה חלבון. יישר רצף חומצות האמיניות היעד לשני האלמנטים המבניים היסודיים ו3D מhomologs בנתוני בנק החלבון (PDB), אם הוא זמין (איור 2). השתמש במידע כדי להפוך את יישור עיצובים לבנות מבנה מונחים על ידי בחירת טרמיני החדש המבוסס על שימור של המבנה הראשי ומבני 3D של homologs. עיצוב הוספת PCR (iPCR) וה-PCR (vPCR) amplimers וקטור (מסוף פריימרים). שימוש בגן ​​cאלגוריתם חלבון ל-DNA של omposer, גב לתרגם את רצף החומצות האמיניות לבנות לתוך רצף חומצות גרעין מהונדס קודון. השתמש בטבלת שימוש קודון המתאימה (חתך) כדי לייעל את הרצף לביטוי בE. coli. כמעט לשכפל להכניס לתוך pET28 הווקטור שונה לשלב תג N-מסוף 6x היסטידין וחלבון היתוך Smt3/SUMO המאפשר לטיהור קלה. בצע את הזמנת גן סינטטי עם DNA 2.0 פריימרים ולהזמין ממשולבי טכנולוגיות ה-DNA. 2. פולימראז הארכת שיבוט פריימר שלא הושלמו (צינור) הכן את צבעי יסוד והגנים צנטריפוגה צלחות היצרן היה פריימרים המכילות ב 1000 סל"ד דקות 1. להביא לריכוז פריימר 100 מיקרומטר ולהוסיף 50 חיץ TE μl. לדלל פריימרים ל10 מיקרומטר עם המים deionized (DI) בצלחת V-96, גם תחתונה. צנטריפוגה גן היצרן היה בצינור 1.5 מ"ל ב1,300 סל"ד דקות 1. <li> שימוש במאגר TE, להביא את ריכוז ה-DNA של כל צינור עד 50 ng / μl. בצינורות 1.5 מ"ל, לבצע דילולים של כל צבע יסוד ל10 ng / μl. פריימרים חנות וגנים ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש. הכן הוספת PCR (iPCR) הפשירי בקבוקון של מיקס מאסטר Pfu על קרח; לשמור על גנים ויחל בטמפרטורת חדר. יצירת מפת צלחת הקצאת בארות לקבוצה של פריימרים ולבנות. הוסף 13 μl של מים די לבאר כל צלחת PCR 96, גם. הוסף 5 μl של קדימה ושל 5 μl פריימר ההפוכה לכל תגובה בצלחת 96 היטב לפי מפת הצלחת, מה שמבטיח לשנות את הטיפים בין כל טוב. הוסף 2 μl של כל גן באורך מלא שלה מתאים היטב לפי מפת הצלחת. הוסף 25 μl של תערובת אמן Pfu היטב כל אחד, מה שמבטיח לשנות את הטיפים בין כל טוב. מחזור את התגובות המשתמשות לתנאים הבאים: PCR ° C 2 דקות 95 </p> 95 ° C 30 שניות 50 ° C 45 שניות 68 ° C 3 דקות 4 מעלות צלזיוס ∞ חזור על שלבי BD במשך 25 מחזורים. העבר את 10 μl של כל תגובת iPCR לצלחת PCR 96, גם חדשה. הוסף 3 μl של צבע עומס 6X לכל דגימה. הפרד כל דגימה ב% טה EtBr agarose ג'ל 1 ב 110 V ליד סולם הדנ"א סל"ש 100-500 כדי לאשר הגברה שבר. מוצר iPCR חנות ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש (למנוע הפשרת הקפאה עד כמה שניתן). 3. הכן וקטור PCR (vPCR) התחל תרבות הלילה של א 'הפכה coli עם pET28 וקטור פלסמיד. שני צינורות לחסן 5 מ"ל של מרק 2-יט עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin. לגדול תרבויות לילה בשעה 37 ° C שבייקר ב 220 סל"ד. ספין למטה תרבויות לאחר צמיחה בין לילה על ידי centrifuging ב -3,000 סל"ד במשך 15 דקות. השתמש QIA Qiagenהכנת ספין Miniprep ערכה לחלץ pET28 וקטור מכדורי חיידקים על פי הוראות היצרן. digestions אנזים הגבלת ההתקנה של חילוץ pET28 פלסמיד. הוסף 2.2 μl של חיץ BamHI 10X וμl 1 של BamHI וHindIII עד 20 μl של pET28 וקטור. דגירה תגובה עבור שעה 1 ב 37 ° C. מוצר עיכול נפרד בג'ל. עיין בשלב 2.2.10. חותכים להקת וקטור מג'ל ולטהר אותו באמצעות ערכת חילוץ ג'ל QIAquick על פי הוראות היצרן. שימוש NanoDrop, לכמת ריכוז ה-DNA. לדלל לחתוך וקטור עד 10 ng / μl. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר אינו בשימוש. הכן פריימרים vPCR. צנטריפוגה oligonucliotides סופק IDT 1 דקות ב1,300 סל"ד. להביא לריכוז במי DI 100 מיקרומטר. הכן 10 מיקרומטר דילול של שני פריימרים קדימה לאחור בצינור 1.5 מ"ל. פריימרים חנות ודילולי פריימר ב -20 ° C. הפשירי מיקס מאסטר Pfu על קרח והפשרת תבנית ופריימרים בטמפרטורת חדר. תגובות vPCR התקנה בצלחת PCR 96, גם: בשורה הראשונה של צלחת 96 היטב לשלב 60 μl של שני פריימרים vPCR קדימה לאחור ו24 μl של pET28 תבנית מתעכלת (10 ng / μl). באמצעות פיפטה רבה של 12 טיפ, להעביר 12 μl של פריימר ותערובת אמן תבנית לכל שנותר גם של הצלחת. זה אמור לגרום μl 12 של פריימר ותערובת אמן תבנית היטב בכל הצלחת. הוסף 13 μl של מים די היטב כל אחד. הוסף 25 μl של מיקס מאסטר Pfu היטב כל אחד. מחזור את התגובות באמצעות PCR תנאי שימוש בשלב 2.2.7. בריכת כל תגובות vPCR לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. ודא הגברה שבר על ידי הפרדת μl 10 של מוצר ה-PCR נקווה על ג'ל (אורך צפוי של pET28 וקטור מתעכלהוא כ 6 KB). עיין בשלב 2.2.10. היכונו למזג צלחות. μl Aliquot 3 של מוצר vPCR לבאר כל צלחת V-96, גם תחתונה. צלחות חנות ב -20 ° C עד מיזוג עם מוצר iPCR. 4. מיזוג iPCR וvPCR מוצרים מוצרי iPCR הפשר וvPCR מראש aliquoted 96, גם למזג צלחת בטמפרטורת חדר. הוסף 3 μl של כל מוצר iPCR לטוב שלו בהתאמה של צלחת המיזוג. להפוך את צלחת מיזוג לעשרה תאים מוסמכים כימי למעלה. הוסף 2 μl של כל תגובה להתמזג לתוך צינור אחד 50 μl של תאים כימיים מוסמכים ידי יצרן ולהמשיך עם הפרוטוקול המצורף של היצרן. הכן תרבויות לילה לכל אחד ממושגים מהפיכת צלחת. מרק Aliquot 5 מיליליטר חפת (עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin) ממאגר סטרילי 25 מ"ל לבאר כל גוש גם עמוק. שימוש Steriטכניקת le, לבחור מושבה מבודדת מכל צלחת שינוי ולחסן גם המתאים של הבלוק גם העמוק. לכסות את הבלוק עם כיסוי Airpore. Shake בלוק ב 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. תאי גלולה ידי צנטריפוגה לחסום למשך 30 דקות ב 4000 סל"ד. יוצק את supernatant וללטף את החלק העליון של הגוש היבש עם מגבת נייר. מיני הכנה באמצעות מנגנון ואקום Qiagen 96, גם בהתאם להוראות היצרן. 5. הכנת מניות גליצרול של מבנים משוכפלים בהצלחה להפוך את ה-DNA משובט בהצלחה תוקף רצף לBL21 (DE3) כימי תאים מוסמכים בהתאם להוראות היצרן. עבור כל אחד ממושגים, פיק מושבה מבודדת אחת מהשינוי (DE3) BL21 ולחסן לתוך 1 מ"ל של מרק 2-יט (עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin). Shake תרבויות ב220 סל"ד עבור שעות 3-4 על 37 ° C. תווית 1.5 מ"לבורג צינור כובע עם המספר הייחודי לבנות זיהוי, מתח תא, ותאריך. הוסף 500 μl של 50% גליצרול ו500 μl של תרבית תאים ולהפוך כמה פעמים. מייד לאחסן מניית גליצרול על קרח יבש או ב-80 ° C במקפיא. 6. בדיקת ביטוי תמוגה buffe R שטוף מאגר הצפת elution 50 מ"מ אא 2 PO 4, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 10 מ"מ imidazole 1% Tween 20 2 מ"מ MgCl 2 0.1 Benzonase μl / מ"ל 1 מ"ג / מיליליטר Lysozyme 50 מ"מ אא 2 PO 4, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 20 מ"מ imidazole 0.05% Tween 20 25 מ"מ טריס, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 250 מ"מ imidazole 0.05% Tween 20 * הוספת Benzonase, ליזוזים,ומעכבי פרוטאז מייד לפני תמוגה. פס מדגם ממניות גליצרול על אגר סלקטיבי kanamycin ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. התחל מראש תרבות הלא וישכנע בבלוק 96, גם סיבוב תחתון; מרק חפת מ"ל 1.2 לחסן (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בתוספת 0.5% גלוקוז עם א 'טרי גדל חיידק בודד. לגדול בין לילה רועד ב 220 סל"ד ב 37 ° C. לאחר צמיחה בין לילה, להתחיל תרבויות אינדוקציה ידי inoculating 1.2 מ"ל של מרק שחפת (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בתוספת Novagen לילה מערכת אקספרס 1 (על פי הפרוטוקול של היצרן) עם 40 μl של טרום התרבות. לגדל את תרבויות אינדוקציה בקנה מידה קטנה על 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, רועד ב220 סל"ד. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 סל"ד במשך 15 דקות, יוצקים את supernatant ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני העיבוד. בבלוק 96 גם, resuspend את כדורי התא ב300 מאגר תמוגה μl. </li> דגירה תאים במאגר תמוגה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ואחריו תמוגה מכאנית על ידי טלטול נמרץ למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. להבהיר lysate הגולמי על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 4000 סל"ד ב 4 ° C. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 200 μl של lysate הבהיר (חלק קטן מסיס) למגש תחתון 96, גם שטוח (Qiagen). לכל המכיל גם מדגם, להוסיף 40 חרוזים Ni-נ.ת. ע מגנטי μl (Qiagen). בעדינות להתסיס את הצלחת על כיסא נדנדה עבור שעה 1 ב 16 ° C. מניחים את הצלחת על צלחת הודעה מגנטית (Qiagen) ולהסיר את החלק היחסי המסיס מאוגד. לדאוג שלא פיפטה את כל החרוזים Ni-נ.ת. ע. הסר את הצלחת מצלחת הפוסט ובעדינות resuspended את החרוזים ב200 חיץ לשטוף μl. פיפטה מעלה ומטה למשך 30 שניות ולאחר מכן למקם את הצלחת בחזרה על צלחת הפרסום. הסר את החיץ לשטוף ולחזור על שלב 6.12. הסר את הצלחת מתפקיד הצלחת וelute Ni-נ.ת. ע מאוגד ת"אחלבון r קבל על ידי שטיפה עם 50 חיץ elution μl למשך 5 דקות. לחזור צלחת תחתית שטוחה לצלחת הודעה מגנטית ולהעביר לצלחת elution V-תחתונה 96, גם טרי. העבר את 20 μl של elution לצלחת V-תחתונה 96, גם טרי ומגיב עם ULP1 פרוטאז μl 1. על פי הפרוטוקול של היצרן, לנתח + Ulp1 שבריר eluted וeluted ידי אלקטרופורזה נימים באמצעות LabChip 90. לחלופין, ניתן לנתח את כל השברים מבדיקת הביטוי באמצעות-SDS. 7. תסיסה בקנה מידה גדולה השתמש בקצה פיפטה סטרילית להשיג לגרד ממניות גליצרול, לחסן מרק TB 100 מ"ל (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) ולגדול בין לילה. Shake ב 220 סל"ד ו 37 ° C. לאחר צמיחה בין לילה, להרחיב מראש על ידי תרבות inoculating 1 ליטר של מרק TB עם פתרונות autoinduction EMD (ראה פרוטוקול של היצרן) (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בבקבוק 2 ליטר מבולבל עם 10 מ"ל שלטרום התרבות (1:100 דילול). לנער את תרבויות 1 ליטר המורחב על 37 מעלות צלזיוס, לשנות את הטמפרטורה של החממה הרועדת עד 20 מעלות צלזיוס, כאשר הוא הגיע צפיפות אופטית של 0.6 (OD 600). לאחר צמיחה בין לילה, לוקח 10 מ"ל aliquot נציג מכל מבנה לבדיקת ביטוי. תא קציר להדביק על ידי צנטריפוגה ב 5000 סל"ד במשך 15 דקות וזורקים supernatant. תא ההקפאה להדביק ב -80 ° C. טיהור חלבונים מאגרים: מאגר תמוגה חיץ (איזון) חיץ B (Elution) שינוי גודל מאגר הטור 25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 0.5% גליצרול 0.02% בחורים 10 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP ארגינין 50 מ"מ 5 Benzonase μl 100 מ 'גרם Lysozyme 3 טבליות מעכבי פרוטאז (EDTA-חינם) 25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 10 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP ארגינין 50 מ"מ 0.25% גליצרול 25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 200 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP 25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 1% גליצרול 1 מ"מ TCEP * הוסף Benzonase, ליזוזים, ולוחות מעכבי פרוטאז לכל דגימה 150 מ"ל מייד לפני תמוגה. 8. תמוגה תא הפוך 2 ליטר של חיץ תמוגה; לא להוסיף ליזוזים, טבליות או מעכבי פרוטאז Benzonase (כל דגימה תהיה lysed בנפרד ב150 מ"ל של חיץ תמוגה). הפשירו וresuspend תא להדביק במאגר תמוגה במסת 01:05: יחס נפח על ידי ערבוב נמרץ למשך 30 דקות ב 4 ° C. לשבור את הגושים רופפים מצדדים של כוס בעזרת מרית נקיות. במהלך פרק זמן זה להכין Ni וdialyחוצצי סים על קרח, lyse התאים באמצעות sonicator Misonix (כוח 70%, 2 שניות ב/ 1 שניות את הפעימות במשך 3 דקות) ובעדינות מערבולת המכל כדי למנוע התחממות יתר. שמור aliquot (200 μl) קטן של lysate הגולמי לניתוח בעתיד. להבהיר lysate הגולמי על ידי צנטריפוגה XG ב 18,000 עבור 35 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant ולשמור aliquot קטן (200 μl) לניתוח בעתיד. חנות גלולה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא אישר את החלבון כבר lysed לשבריר המסיס. 9. התקנת אמצעים לחלבון לפני ריצה עם יצרנית החלבון מופעלת והתוכנה פתוחה, לאתחל את המכשיר. ברגע שאותחל, לצרף עמודה אחת 5.0 מיליליטר GE Healthcare HisTrap FF ניקל chelate (Ni עמודה) בשורה נפרדת של gantry לכל אחת מהדגימות. הפעל כרכי 3-4 עמודות (קורות חיים) של חיץ איזון באמצעות כל עמודה. להכין את קווי חיץ elution האיזון ו. Equilibrאכלתי את העמודות על ידי aspirating חיץ דרך העמודה פעם אחת. 10. ניקל טור 1 (Ni1) שטוף כל עמודה עם 20 מים מילי-Q מ"ל להסיר חיץ אחסון. לרוץ 5 מיליליטר חיץ חיץ 25 מ"ל לאיזון B ו. טען lysate הבהיר המכיל חלבון solubilized לעמודות בשיעור של 2 מ"ל / דקה לאחר מכן בצעתי על ידי שטיפת 15 מ"ל עם החיץ א Elute החלבון המאוגד בשיפוע צעד עם חוצצי A ו-B על ידי היחסים הבאים ביראת הכבוד: 5 95:5 מ"ל, 5 מ"ל 60:40, 10 מ"ל 0:100. לאסוף כל חלק elution בנפרד. ניתוח: שברים eluted, lysate הגולמי, lysate הבהיר, וזרימה דרך ידי-SDS. ברי בריכת המכילים חלבון ולהשתמש Nanodrop למדוד 280 כדי לקבוע את כמות חלבון בהווה בגסות. 11. ULP1 מחשוף שמור aliquot קטן (250 μl) של בריכת עמודת Ni1 לניתוח ג'ל שלאחר מכן. להביא את שארבבריכת Ni1 עד 10 מ"ל ולהוסיף פרוטאז כמו היוביקוויטין 1 (ULP1) בμl 1/5 מ"ג של חלבון הכולל כדי להסיר את תג זיקתו-SMT. Dialyze בריכת Ni1 + ULP1 נגד 2 ליטר של חיץ לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס ב10 kDa גזור משקל מולקולרי (MWCO) על צלחת ומערבבים ב 4 ° C. לאחר דיאליזה, לרוץ-SDS של Ni1 בריכת וברכה Ni1 + ULP1 כדי לקבוע אם ULP1 המחשוף היה מוצלח. 12. ניקל עמודה 2 (NI2) טען חלבון ביקע על אותה עמודת Ni וחזור על שלב 9.3 בקצב זרימה מופחת של 1 מ"ל / דקה. התג ביקע את יהיה לאגד את העמודה וחלבון מטרת tagless עכשיו יזרום דרכו. לאסוף את הזרימה דרכו במכל טרי. שטוף עמודת Ni עם חיץ מ"ל 3 ואחרי 5 מ"ל של החיץ B לelute כל החלבון מתויג-ונכרך nonspecifically. לאסוף כל חלק בנפרד. הפעל-SDS של NI2 זרימה דרך, לשטוף וNI2 השברים elution לאמת ULP1 מחשוף ושיחסי הציבורotein נמצא בזרימת הדרך. השתמש Nanodrop למדוד 280 כדי לקבוע את נוכחותו של חלבון בגסות. 13. ריכוז לרכז את הזרימה דרך NI2 (וNI2 elution אם חלבון הוא הווה) עד 5 מ"ל עם צינור Amicon Ultra 10 kDa MWCO צנטריפוגות. ספין במרווחים של 10 דקות ב 4000 סל"ד ב 4 ° C. מערבבים עם טפטפת בין כל סיבוב כדי למנוע מחלבון מעל להתרכז לאורך הממברנה. 14. כרומטוגרפיה גודל-הדרה (ה-SEC) הגדר את ה-S-100 10/30 GL עמודת Sephacryl (GE Healthcare) על ידי equilibrating עם 200 מיליליטר חיץ-SEC בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה במערכת AKTApurifier (GE Healthcare). הכן 10 מ"ל superloops לשימוש בעמודת ה-SEC לפי הוראות היצרן. באמצעות מזרק 5 מ"ל, טען דגימות על superloops ולהתחיל את ריצת ה-SEC. לעקוב אחר עקבות UV-הספיגה ב 280 ננומטר תוך איסוף קטן נפח frפעולות. הפעלה באמצעות שברי SEC-SDS. הברכה שברי SEC מראים הלהקות בעוצמה הגבוהות ביותר. להתרכז שברים SEC ויקוו. עיין בשלב 13.1. חלבון Aliquot לתוך 100 דגימות μl, הקפאת הבזק בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. התגבשות 15. התגבשות חלבון מראש למלא כל מאגר של צלחת התגבשות ג'וניור 96, גם קומפקטית (אמרלד ביו) עם 80 μl של מסך התגבשות (אמרלד ביו) של בחירה. לדלל חלבון עם שינוי גודל מאגר כדי 2-20 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן על קרח. לוותר על 0.4 μl של חלבון ו0.4 μl של מסך גיבוש לכל אחד מ96 הבארות ולכסות עם סרט איטום צלול (Manco). אחסן את הצלחת על 16 מעלות צלזיוס במהלך בדיקת התגבשות חלבון מעת לעת במהלך השבועות הקרובים תחת מיקרוסקופ לנתח. 16. קציר גביש </P> צור cryoprotectant ממשקאות האמא ואתילן גליקול. חותכים את הקלטת ברורה מכסה היטב עם גביש חלבון המטרה. כדי גם ריק, להוסיף 1.6 μl של מצב ההתגבשות המקביל ולשלב עם 0.4 μl של אתילן גליקול מניב ריכוז סופי של 20% אתילן גליקול ו80% ​​גיבוש מצב. הערה: כדי לייעל את עקיפת גביש מנסה cryoprotectants שונה כגון: גליצרול, שמנים, glycols פוליאתילן MW נמוך, ו / או בשינוי אחוזי cryoprotectant. לפני הקצירה להתקרר דיסקוס ALS בסגנון בדיואר מלא בחנקן נוזלי ומכסים במכסה. קציר הגביש על ידי הצבת CryoLoop עם הקוטר הפנימי התאמת הגודל של הגביש בשרביט קריסטל מגנטי (Hampton מחקר) ולגרוף אותו ישירות מהפתרון גם. מייד לטבול CryoLoop עם הגביש נקטף לאז לצלול cryoprotectant בדיסקוס ALS בסגנון פלאש להקפיא את גrystal. חזור על פעולה עבור מספר רצוי של גבישים. 17. אוסף הקרנה / נתונים קריסטל ברגע קצירת הושלמה להשתמש שרביט דיסקוס למקם את המכסה דיסקוס cryo המגנטית על דיסקוס ALS. עם מלקחיים מכופפים, להפוך את הדיסקית במהופך. העבר את הדיסקית לשחקן Rigaku דיואר, לדפוק Pusher פאק על דיסקוס, אגרוף ואת המכסה והשאירה אותו בדיואר עם סיכות עם פנים כלפי מעלה. באמצעות תוכנת JDirector, מסך כל גביש תחת הפרמטרים הבאים: שסע קרן מוגדר 0.5 מעלות, מרחק הגלאי להגדיר עד 50 מ"מ, צעד תמונה עד 70 מעלות, ואורך חשיפה להגדיר עד 30 שניות. הפעל Mosflm על התמונות שצלמתם עם בדיקת JDirector לקבוע מה הגביש והאסטרטגיה הטובים ביותר הוא לאיסוף נתונים. איסוף מערך נתונים שלמים הבוסס על התוצאות שלך מMosflm. 18. עיבוד נתונים / קביעת מבנה הפעל XDS / XScale 4 לעבד את הנתונים. פתח את חבילת תוכנת CCP4. הפעל Phaser 5 לחשב פתרון החלפה מולקולרי תוך שימוש במודל חיפוש הומולוגיה גבוה, כאשר זמין. במקרה זה השתמשנו ב3CW4 PDBID כמודל חיפוש 6. הפעל Refmac 7 לעדן המודל המולקולרי שלך נגד ההשתקפות הנצפית נאספה בבסיס הנתונים. החלטה סופית צריכה להיות מבוסס על הנחה של הפגז הגבוה ביותר ונקבעה על ידי הפרמטרים הבאים: R פקטור> 50%, אני / סיגמא> 2, ושלמות> 90%. לבנות מודל צפיפות אלקטרונים 3 ממדים עם תוכנות גרפיקה מולקולריות הקרסול 8. לפני ההפקדה במבנה PDB לאמת אותו עם תוכנת MolProbity 9 כדי לוודא שאיכות של מבנה מתאים לתצהיר.