Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie
Summary
Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.
Abstract
Om de rol van een gen in de ontwikkeling van colitis begrijpen, vergeleken we de reactie van wild-type muizen en gen-van-belang deficiënte knockout muizen colitis. Als het gen-van-belang wordt uitgedrukt in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen van de gastheer, maar is het mogelijk om de rol van een gen van belang onderscheid in van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen door beenmergtransplantatie techniek. Het beenmerg afgeleide cellen genotype muizen veranderen, werden de oorspronkelijke beenmerg van ontvangende muizen vernietigd door bestraling en vervangen door nieuwe donor beenmerg van verschillende genotype. Wanneer wild-type muizen donor beenmerg getransplanteerd knockout muizen, kunnen we genereren knockout muizen met wild-type genexpressie in van beenmerg afgeleide cellen. Als alternatief werd toen knockout muizen donor beenmerg getransplanteerd naar wild-type ontvangende muizen, wild-type muizen zonder gen-van-een blijk van belangstellingvan beenmerg afgeleide cellen geproduceerd. Kan echter beenmergtransplantatie niet 100% volledig zijn. Daarom gebruikten we cluster van differentiatie (CD) moleculen (CD45.1 en CD45.2) als markers van donor en ontvangende cellen het percentage van donor beenmerg afgeleide cellen in de ontvangende muizen en succesvolle beenmergtransplantatie volgen. Wild-type muizen met CD45.1 genotype en knockout muizen met CD45.2 genotype werden gebruikt. Na bestraling van ontvangende muizen werden de donor beenmergcellen van verschillende genotypen ingebracht in de ontvangende muizen. Wanneer de nieuwe beenmerg geregenereerde over te nemen immuniteit, werden de muizen uitgedaagd door chemisch middel (dextran natriumsulfaat, DSS 5%) colitis te induceren. Hier bleek ook de methode colitis te induceren in muizen en evalueren van de rol van het gen van interesse tot expressie gebracht uit beenmerg afgeleide cellen. Als het gen-van-belang van het bot afgeleide cellen speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de ziekte (zoals colitis), kan het fenotype van de ontvangende muizen met beenmergtransplantatie aanzienlijk worden gewijzigd. Eind colitis experimenten, het beenmerg afgeleide cellen in bloed en beenmerg werden gemerkt met antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 en de kwantitatieve verhouding bestaan kunnen worden gebruikt om het succes van beenmergtransplantatie door flowcytometrie evalueren. Succesvolle beenmergtransplantatie moeten tonen een grote meerderheid van de donor genotype (in termen van CD molecule marker) over de ontvanger genotype in zowel het beenmerg en het bloed van de ontvanger muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze beenmergtransplantatie aanpak is geschikt voor immunologie van colitis, infecties, kanker, obesitas en andere aandoeningen. Dit experiment beenmergtransplantatie nodig wanneer het gen-van-belang wordt uitgedrukt in beide afgeleid beenmerg en niet-beenmerg afgeleide cellen en het gen-van-belang vermoedelijk ziekte bemiddelen door cellen van beide populatie. Bijvoorbeeld, antimicrobiële peptide cathelicidine aangetoond moduleren acute colitis. Maar wordt uitgedrukt in zowel epitheelcellen en immuuncellen (zoals macr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Pilot en haalbaarheidsstudie subsidie van UCLA-CURE Center, de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) en National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) financiering van Hon Wai Koon.
Beenmerg bestraling operatie werd bijgestaan door Bernard Levin en Scott Keuken van UCLA Center for AIDS Research muis / humaan Chimera Core faciliteit. Flowcytometrie operatie werd bijgestaan door UCLA Vector Core faciliteit.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
| Vaccutainer | BD | #8000813 |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
| Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
Referências
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
