JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

<em> במבחנה</em> שיתוף זיהום דגם ללמוד<em> Plasmodium falciparum</em>-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Published: August 15, 2012
doi:
10.3791/4166
, , , ,
1Infectious Disease Research Center,CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

Summary

פיתחנו<em> במבחנה</em> מלריה-HIV-1 שיתוף זיהום מודל ללמוד את ההשפעה של<em> Plasmodium falciparum</em> על מחזור HIV-1 replicative של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. מערכת זו צדדי יכול בקלות להיות מותאם אחרים סוגי התאים העיקריים לסכנת הדבקה ב-HIV-1.

Abstract

Plasmodium falciparum, הסוכן סיבתי של הטופס הקטלני ביותר של מלריה, נגיף האיידס סוג-1 (HIV-1) הם בין הבעיות הבריאותיות החשובות ביותר ברחבי העולם, להיות אחראי על סך של 4 מיליון מקרי מוות בשנה 1. בשל החפיפה נרחבים שלהם באזורים המתפתחים, בעיקר באפריקה שמדרום לסהרה, עמיתים זיהומים עם מלריה ו-HIV-1 נפוצים, אבל את משחק הגומלין בין שתי המחלות הוא הבין היטב. דיווחים אפידמיולוגיים הראו כי זיהום מלריה זמני משפר HIV-1 שכפול ומגדיל עומס נגיפי HIV-1 ב שיתוף נגועים אנשים 2,3. בגלל viremia זה נשאר גבוה במשך כמה שבועות לאחר טיפול antimalarials, תופעה זו עשויה להיות השפעה על התקדמות המחלה ואת השידור.

מנגנוני החיסונית סלולריים מאחורי תצפיות אלו נחקרו רק בקושי. כמה מחקרים במבחנה investigating את ההשפעה של מלריה ב-HIV-1 הראו כי חשיפה אנטיגנים מלריה מסיסים יכולים להגדיל את ה-HIV-1 זיהום מחדש של תאים חיסוניים. עם זאת, מחקרים אלה השתמשו תמציות תאים שלמים של פ ' falciparum schizont טפילים בשלב ותאי דם היקפיים (mononuclear PBMC), מה שהופך את זה קשה לפענח איזה מרכיב מלריה (ים) היה אחראי על תופעות שנצפו ומה מארחים את התאים היעד היו 4,5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חשיפה של מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים בשלים על פיגמנט hemozoin מלריה עלה יכולתם להעביר HIV-1 אל התאים CD4 + טי 6,7, אבל זה ירד זיהום HIV-1 של מקרופאגים 8. כדי לשפוך אור על תהליך מורכב זה, ניתוח שיטתי של אינטראקציות בין טפיל המלריה ו-HIV-1 של אוכלוסיות אנושיות שונות הרלוונטיות תאים ראשוניים יש צורך קריטי.

כמה טכניקות לחקור את ההשפעה של HIV-1 על phagocytosis של מיקרואורגניזמים ועל ההשפעה של פתוגנים כאלה על שכפול ה-HIV-1 תוארו. אנחנו כאן להציג שיטה לחקור את ההשפעות של פ ' falciparum נגועים אריתרוציטים על שכפול של HIV-1 של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. ההשפעה של החשיפה טפיל על HIV-1 תעתיק / translational אירועים מנוטר באמצעות וירוסים מחזור יחיד pseudotyped שבו הגן כתב בלוציפראז החליף את הגן Env תוך השפעה על כמות של נגיף שפורסמו על ידי מקרופאגים נגועים נקבע על ידי מדידת HIV-1 החלבון p24 capsid ידי ELISA ב supernatants סלולריים.

Protocol

הערה: ניסויים עם HIV-1 ו-Plasmodium falciparum חייב להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית נאותה במעבדות (BSL2 על טפילים, ו BSL3 ל-HIV-1 ו שיתוף זיהומים) ו זהירות מיוחדת יש לנקוט בעת שימוש בדם אדם נגוע פוטנציאלי. 1. תאים דם היקפיים mononuclear (PBMC) טיהור (בהתבסס על 8 ו 9) התחל עם דם אדם טרי מתורמים בריאים (500 מ"ל) שטופלו עם תרופות נגד קרישת דם (הפרין, ציטרט חומצה ציטרט דקסטרוז או ציטראט פוספט דקסטרוז). השתמש רעלן פנימי ללא חומרים כימיים כאשר טיהור ובידוד PBMC ובכל השאר לפרוטוקול. לחטא את שקית הדם, כולל צינור, עם אתנול 70%, לחתוך את הצינור בזהירות להעביר את הדם לתוך בקבוקון T150. הכן 16 מבחנות עם המדיום 15 מ"ל לימפוציטים ההפרדה (Ficoll) לכל צינור מ"ל 50 חרוטי (לוודא Ficoll הגיע בטמפרטורת החדר).בזהירות בשכבת 30 מ"ל של דם טרי על העליונה. צנטריפוגה ב XG 400 למשך 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם משתתקת. במהלך צנטריפוגה, להכין 8 x 50 מ"ל צינורות בצורת חרוט עם 25 מ"ל של תמיסת מלח בטמפרטורת החדר מאוזן של האנק (HBSS) לכל צינור. להעביר בזהירות את הטבעת תא מעונן על הממשק (מכיל PBMC) לצינור 50 מ"ל המכיל HBSS (2 בריכת סלולריים טבעות לכל צינור). השלם כרכים עד 50 מ"ל עם HBSS. צנטריפוגה ב XG 150 במשך 15 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הפסקות על. במהלך צנטריפוגה של הטבעת תא מעונן, לאסוף את השכבה העליונה צהוב משלב Ficoll, בריכת פלזמה למלא צינור חרוטי 50 מ"ל. להשבית להשלים פלזמה ידי חימום שפופרת 50 מ"ל ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו 10 דקות לסובב ב 1800 x גרם. שמור supernatant (כולל פלזמה עצמיים בדילול שניתן להשתמש בו כתוסף בינוני על שלבים מאוחרים יותר). מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspenד תא גלולה משלב 1.7 ב 25 מ"ל של HBSS ובריכת 2 כדורי לכל שפופרת 50 מ"ל. מסובבים XG 300 דקות 8 ב 20 ° C. הסר את supernatant בזהירות resuspend את כדורי ב 10 מ"ל HBSS ובריכת של צינור 50 1 מ"ל. קח aliquot, לבצע הרחקה trypan כחול להעריך תמותה ואז לספור PBMC. נפח מוחלטת עם 50 מ"ל HBSS ו 10 דקות ספין ב 300 x גרם. הסר את supernatant ו resuspend התאים RPMI 1640 ב 5×10 6 תאים למ"ל (יש להשיג סביב PBMC 400-500 6 x 10 מ 500 מ"ל דם). 2. מונוציטים הנגזרות המקרופאגים (MDM) התמיינות (בהתבסס על 8 ו 9) כ 1.25 Seed x 10 8 PBMC ב -15 מנות ס"מ עם RPMI 1640 (25 מ"ל / צלחת). בואו תאים לדבוק עבור שעות 1-2 על 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2. העברת תאים שאינם דבקו בבקבוק חדש לשטוף צלחת עם 15 רעלן פנימי ללא מ"ל PBS פעמיים (5דק ', 300 XG). התאים הם דבקו מונוציטים מבודדים. כדי לאפשר מונוציטים מבודדים טרי להתמיין MDM, להוסיף 20 מ"ל של מדיום 1640 RPMI השלימו עם פלזמה עצמיים 5% (מ שלב 1.8). הוסף מושבה אנושית רקומביננטי מקרופגים גורם מגרה (M-CSF, 25 ng / ml) ו פניצילין / סטרפטומיצין פתרון (PS, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין). דגירה של 2 ימים, שנה בינונית דגירה 2-3 ימים נוספים על 37 מעלות צלזיוס ב -5% 2 CO באטמוספירה. הסר בינוני בן ולשטוף עם רעלן פנימי ללא PBS פעם, מוסיפים את PBS בעדינות לשאוב מיד. לנתק MDM הבדיל באופן מלא, לטיפול תאים עם ~ 7 מ"ל Accutase (Accutase, תערובת זמינים מסחרית של פרוטאזות ופעילות collagenolytic המאפשרים ניתוק של תאים צלחת פלסטיק) של 15-20 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס ב CO 5% 2 האווירה, לטלטל בעדינות בזמן באמצע. הוסף 3-5 מ"ל פלזמה עצמיים (משלב 1.8) על כל צלחת (כדי להגן על התאים תוךמגרדים). בעדינות לגרד תאים ולוודא בינוני מכסה את התאים בכל הזמנים והעברת / בריכה של צינור 50 מ"ל. יש לשטוף צלחות עם רעלן פנימי ללא PBS להתאושש כמו תאים רבים ככל האפשר. ספין 5 דק 'ב 200 XG, לבטל supernatant. Resuspend גלולה במדיום 5 MDM תרבות מ"ל (RPMI 1640 השלימו עם סרום המשלים-מומת 10% שור עוברית (iFBS), PS, HEPES 25 מ"מ) תאים Count (MDM להניב בדרך כלל 2-8% של PBMC הכל). הערה: aliquot של MDM תילקח בשלב זה להעריך את האוכלוסייה טוהר התא על ידי cytometry זרימה, בדרך כלל 99% שהושג MDM אקספרס CD14. 1×10 זרע 5 MDM ב μl 600 של המדיום תרבות MDM לכל טוב 24 גם הצלחות. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2 לפני זיהומים. 3. ייצור quantitation של HIV-1 מניות ויראלי לייצר מניות ויראלי באמצעות פוספט transfection הסידן HEK293T תאים folloפרוטוקול הזרוע של פורטין et al. 10. על מנת לקבל וירוסים מחזור יחיד המכיל את הגן בלוציפראז קידוד הכתב, שיתוף transfect תאים HEK293T עם 20 מיקרוגרם אחד NL4.3 לוק + Env – R + ו 10 מיקרוגרם של pHCMV-G, או 15 מיקרוגרם של NL4.3 לוק + Env – R + ו – 15 מיקרוגרם של pJRFL env. השתמש 30 מיקרוגרם של NL4.3 לוק + Env – R + ליצור גליקופרוטאין לקוי וירוסים מלאה. וירוס replicative מלא, השתמש 30 מיקרוגרם של NL4.3Bal env. הווקטורים pHCMV-G ו pJRFL Env לקודד את גליקופרוטאינים המעטפת של נגיף stomatitis שלפוחי (VSV-G) של חוג CXCR5-HIV-1 (שונה NL4.3Bal env), בהתאמה. פרטים נוספים על פלסמידים ניתן להשיג 8. פלסמידים ניתן לקבל איידס NIH מחקר תוכנית הפניה (NIAID, NIH). לכמת את כל מניות ויראלי באמצעות ELISA לחלבון capsid HIV-1 p24 11, ולוודא פוטנציאל זיהומי שלהם לפני השימוש. אנו מעריכים infectivity של מניות וירוס שלנו באמצעות TZM-BL תאים מחוון 12. 4. התרבות של טפילים Plasmodium falciparum (על בסיס 13) 4.1 תרבות תחזוקה כללית של טפילים לשמור על פ ' falciparum 3D7 טפילים בשלב מיניים ב אריתרוציטים אדם (דם קבוצת O +) ב המטוקריט 4% RPMI 1640 (שנאגרו עם 25 HEPES מ"מ ו 25 מ"מ NaHCO 3) בתוספת 0.5% (W / V) Albumax השנייה, 25 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין ו Hypoxanthine 370μM ב 37 ° C בתערובת גז חמצן 1% / 5% פחמן דו חמצני בחנקן. Parasitemia יכול להיות פיקוח על ידי יצירת משטח דק של התרבות מכתים פתרון Giemsa 15%. תמיד לשמור על תאים נגוע דם אדומים (uRBC) צלחת תרבות באותם תנאים כמו טפילים להשתמש כביקורת. כדי להשיג parasit בשלב מאוחרES (trophozoites / schizonts המוקדמות), לסנכרן את הטפילים כדלקמן: 4.2 טפיל סינכרון בבוקר, לאסוף את התרבות הטפיל, 5 דק 'ספין על XG 300 וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב -5 כרכים סלולריים עמוסים% 5 (W / V) D-סורביטול ו דגירה 5 דק 'ב 37 ° C. ספין 5 דק 'ב 300 x גרם, לבטל supernatant, resuspend גלולה במדיום תרבות 30 מ"ל ו להחזיר את החממה. כ 8 שעות לאחר מכן, חזור על שלבים 4.2.1 ל 4.2.3 על מנת לקבל טפילים מסונכרנים היטב. טפילים בשלב מאוחר (trophozoites / schizonts המוקדמות) לאחר מכן ניתן לקצור למחרת בבוקר כדי לבצע את הניסוי. לפני טיהור, לבצע צביעה Giemsa לאשר בשלב מחזור החיים. 4.3 Plasmodium falciparum נגועים בתאי דם אדומים (iRBC) טיהור לעקר מפריד VarioMacs (עמדה מגנט) עם 70% אתנול ו-Pקושרת אותה מתחת למכסה המנוע ביולוגי. לתקן שסתום משולשת לתחתית העמודה CS. חותכים את הקצה של מגן מחט פלסטיק עם אביזר מיוחד Miltenyi ולתקן את המחט למטה שסתום. לנעול את הטור לאבן שואבת בזהירות. הסר את כל בועות האוויר בעמודה על ידי הזרקת לאט 10 מ"ל של מדיום תרבות MDM בעזרת מזרק ערכת סגורה דפוק בצד השמאלי של שסתום. לשטוף את הטור עם 20 ~ בינוני תרבות MDM מ"ל. קציר RBC מהצלחת תרבות, לשטוף פעם אחת עם המדיום MDM 10 מ"ל (300 XG, 5 דק ') ו resuspend גלולה RBC ב 12 בינוני תרבות מ"ל MDM. לאט לאט להוסיף לטור ולתת את זרימת ההשעיה עד (רק תאים נגועים הדם האדומים המכילים טפילים trophozoite או בשלב schizont יישמרו על ידי השדה המגנטי עקב נוכחות של גבישים hemozoin). לשטוף פעם אחת עם המדיום 20 מ"ל ולהפסיק את זרימת הנוזל כאשר הוא מגיע דיסק לבן על גבי העמוד. הסר את העמודה מגנט ו iRBC elute בצינור סטרילי נקי בינוני עם 12 מ"ל תרבות MDM. Aliquot כתם של iRBC התאושש ולבצע Giemsa מכתים לאשר בשלב מחזור החיים. ספירת iRBC התאושש באמצעות haemocytometer (מבודד RBC הם iRBC 100%). תאים גלולה (300 XG, 5 דק '), לבטל supernatant ולטפל תאים עם 500 AB טרי μl + סרום אדם (שלב opsonisation 14). דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. לשטוף פעם אחת עם 10 בינוני MDM תרבות מ"ל (300 x גרם, 5 דק '), ו resuspend iRBC לריכוז הרצוי. בדרך כלל, 10% parasitemia 15 ס"מ צלחת התרבות בערך נותן ~ 0.5-1×10 8 iRBC מסונכרן היטב. 5. חשיפה של MDM כדי Plasmodium falciparum לחשוף את MDM כדי uRBC או iRBC, תאים יש resuspended במדיום תרבות MDM על מנת לקבל יחס של uRBC / iRBC: MDM של 75:1. ב בעברמוכן גם 24 לוחות המכילים MDM, להוסיף נפח מתאים RBC ההשעיה היטב כל אחד מהם. לבצע את כל הניסויים בשלושה העתקים. דגירה שיתוף תרבויות עבור שעות 4 ב 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. שוטפים את התאים עם 600 μl של רעלן פנימי ללא PBS 3 פעמים, מוסיפים את PBS בעדינות לשאוב מיד. כדי lyse RBC הנותרים, לשטוף את הבארות על ידי הוספת 200 μl של מים קרים כקרח סטרילית של 20 שניות ו aspirate. הוסף 600 μl בינוני תרבות MDM ו דגירה 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. 6. זיהום של MDM עם replicative לגמרי HIV-1 על מנת להעריך את ההשפעה של פ ' falciparum על שכפול ה-HIV-1 ב MDM, להוסיף, על פי התוכנית המפורטת איור 1 א ', 10 ng של p24 (ב μl 300 של MDM מדיה) של NL4.3Bal וירוסים env ב בארות המתאים, להוסיף רק בינוני MDM בשליטה בארות . דגירה 2 שעה ב 37 מעלות 5% CO 2 באטמוספירה. שוטפים את התאים עם רעלן פנימי ללא PBS 3 פעמים, מוסיפים את PBS בעדינות לשאוב מיד. הוסף 600 μl של המדיום MDM טריים בכל טוב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. לאחר 3 ימים, 6, 9 ו 12 לאחר תחילתו של זיהום ויראלי, הקציר 200 μl של supernatant כל, הוספת 200 μl של המדיום MDM טרי לאחר מכן. שמור את supernatants שנקטפו ב -20 ° C כדי לכמת את החלבון העיקרי-1-HIV p24 capsid ידי ELISA לאחר פורטין et al. 10. 7. זיהום של MDM עם וירוס יחיד בלוציפראז מחזור קידוד על מנת לקבוע את ההשפעה של טפיל על הביטוי 1-HIV גנים MDM, להוסיף, על פי התוכנית המפורטת איור 1 ב ', 10 ng p24 (ב μl 300 בינוני MDM) של או NL4.3 לוק + Env – R + ( VSV-G), NL4.3 לוק + Env – R + (JRFL env) או NL4.3 לוק +Env – R + וירוסים בארות המקביל. דגירה 2 שעה ב 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. שוטפים את התאים עם 600 μl של רעלן פנימי ללא PBS 3 פעמים, מוסיפים את PBS בעדינות לשאוב מיד. הוסף 600 μl של המדיום MDM טריים בכל טוב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס האווירה 5% CO 2. הסר את זיהום בינוני 72 שעות הבאה ולהוסיף 200 μl של תמוגה חיץ 1X (מסופק עם ערכת בלוציפראז assay). בואו התאים lyse בטמפרטורת החדר עם הרעידות עדין. חנות ב -20 ° C. להפשיר את הצלחת להעביר 40 μl של lysate לצלחת 96-Luminometer היטב, מוסיפים 100 μl של המצע בלוציפראז (מסופק עם ערכת assay בלוציפראז) ולמדוד את הפעילות בלוציפראז (Firefly בלוציפראז) ב Luminometer אחרי הוראות היצרן. 8. נציג תוצאות באמצעות מודל שיתוף זיהום שלנו, אנו מראים כי exposurהדואר של פ ' falciparum אל MDM פוחתת הרגישות שלהם זיהום HIV-1. אכן, ירידה משמעותית (p <0.05, 2 דרך ANOVA, יום 12) במהדורה של חלקיקים נגיפיים, כפי שנמדד על ידי חלבון HIV-1 capsid p24 ב supernatant, הוא ציין MDM pretreated עם טפילים (איור 2 א). תצפית זו הוא אישר בתאים נגועים על ידי וירוסים קידוד גנטי בלוציפראז, כתב. זיהום MDM עם וירוסים כאלה מחסה או אקסוגני VSV-G או HIV-1 גליקופרוטאינים מוביל ייצור משמעותית (p <0.05, של סטודנטים מבחן t) בלוציפראז פחות בתאים שנחשפו פ falciparum (איור 2 ב). ראוי לציין כי VSV-G-pseudotyped וירוסים הניבה פעילות בלוציפראז הרבה יותר מאשר עמיתיהם JRFLenv שלהם, וזאת בשל יעילות גבוהה יותר של זיהום VSV-G חלקיקים pseudotyped 15. בהתחשב בכך טפיל התערוכה כדי ההשפעות MDM שני סוגי וירוסים, זה מצביע על כך הוא משפיע על כמה צעד לשעבר הגן הנגיפידיכאון (איור 2 ב). כמו כן, חשוב לציין כי כדאיות התא לא הושפע על ידי MDM התערוכה כדי iRBC (מידע לא מוצג), המציין כי עיכוב ציין ספציפית ולא בשל תמותת תאים. באיור 1. א) פלייט ערכת לזיהום MDM בווירוס replicative מלא מוק. תאים נגוע. uRBC: תאים שנחשפו נגוע כדוריות דם אדומות. iRBC: תאים שנחשפו Plasmodium falciparum נגועים בתאי דם אדומים. באל: תאים נגועים NL4.3Bal Env באל / uRBC:. התאים נחשפים uRBC ו נגוע NL4.3Bal Env באל / iRBC:.. התאים נחשפים iRBC והודבקו NL4.3Bal Env ב ') ערכת צלחת עם זיהום MDM הנגיף בודד בלוציפראז קידוד מחזור מוק. תאים נגוע. uRBC: תאים שנחשפו נגוע כדוריות דם אדומות. iRBC: תאים שנחשפו Plasmodium falciparum-infected כדוריות דם אדומות. Δenv: תאים נגועים NL4.3 לוק + Env – R + JRFL:. תאים נגועים NL4.3 לוק + Env – R + (JRFL env). VSV-G: תאים נגועים NL4.3 לוק + Env – R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. תאים נחשפים uRBC ו נגוע NL4.3 לוק + Env-R + Δenv / iRBC: תאים שנחשפו iRBC וגם נגוע NL4.3 לוק + Env – R + JRFL / uRBC: תאים שנחשפו uRBC ו נגוע NL4.3 לוק + Env – R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: תאים שנחשפו iRBC ו נגוע NL4.3 לוק + Env – R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: תאים שנחשפו uRBC ו נגוע NL4.3 לוק + Env – R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. התאים נחשפים iRBC ו נגוע NL4.3 לוק + Env – R + (VSV-G). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> איור 2. .) השפעת Plasmodium falciparum על ייצור ה-HIV-1 ויראלי MDM MDM נחשפו uRBC או iRBC על יחס 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) עבור 4 שעות ורחץ בהרחבה. התאים נדבקו 10ng של NL4.3Bal Env p24 עבור שעות 2. ייצור ויראלי היה פיקוח על ידי ELISA ל-HIV-1 ב supernatant p24 בתא ללא בנקודות זמן שונות לאחר זיהום ויראלי הראשוני. הניסוי נציג מוצג B) השפעת Plasmodium falciparum על שעתוק-1-HIV ויראלי MDM MDM נדבקו uRBC או iRBC על יחס 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). התאים נדבקו אז עם 10ng של p24 של וירוס מחזור אחד (או NL4.3 לוק + Env – R +, NL4.3 לוק + Env – R + (JRFL env) או NL4.3 לוק + Env – R + (VSV- ז)). הביטוי בלוציפראז הוערך בתא lysates 72 שעות לאחר ההדבקה הראשונית הנגיף. הניסוי נציג מוצג.

Discussion

הדגמנו כאן שתי גישות שונות לנתח את ההשפעה של טפיל המלריה על מחזור 1-HIV ויראלי, כלומר על ידי ניתוח או ביטוי גנים ויראלי או וירוס הצאצאים ייצור שכפול מונוציטים הנגזרות מקרופאגים. גישות דומות שימשו במשך שני HIV-1-טפיל שיתוף זיהומים 16. עם זאת, אלה הנתונים החדשים הם צעד קדימה בחקירה של מלריה-HIV-1 עמיתים זיהומים. . אכן, Diou ואח' 8 בחן את ההשפעה של hemozoin, טפילים לא חיים, על שכפול HIV-1, בהסכם עם התוצאות שלנו, הם הבחינו כי hemozoin עצמו היה מספיק כדי לדכא ייצור ויראלי ידי MDM, ולא MDMs.

באמצעות פריסת הניסוי המתואר, הבחנו כי פ falciparum מפעיל השפעה מזיקה ברורה על מחזור HIV-1 replicative ב מקרופאגים: עיכוב משמעותי של ייצור ויראלי הוא ציין מקרופאגים מראש שנחשפו טפילים (Figurה 2 א) וכן השפעה מסוימת של הטפיל על שעתוק ויראלי ממחישה 2B איור. עם זאת, אנחנו לא יכולים להשאיר את כל תופעות נוספות של הטפיל על כניסת היתוך או ויראלי (decapsidation) או לאחר שילוב מנגנונים, כגון סינתזה של חלבון או הרכבה החלקיקים ויראלי ניצני. יתר על כן, ייתכן כי השפעה שונה על שכפול HIV-1 היה לקבל אם הטפיל נוספו גם בעת ובעונה אחת או זיהום MDM הבאה עם הנגיף.

שלנו במודל שיתוף זיהום חוץ גופית מספק כלי רב עוצמה כדי לבצע חקירות מפורטות של HIV-1 / פ ' אינטראקציות falciparum של התא המארח. לדוגמה, שילוב של פריסת זה ניסיוני עם טכניקות אחרות, כגון PCR כמותי זמן אמיתי, שיכול למקד ולכמת צעדים ספציפיים retrotranscription ויראלי ואינטגרציה הגנום הנגיפי אל התא המארח הגנום, הם ריאלי למדי, צריך להניב insi נוסףghts לתוך המנגנונים המעורבים שיתוף זיהומים. יתר על כן, מבחני ספציפיות על מנת להעריך הצעדים הראשונים של מחזור נגיפית (ויראלית היתוך, decapsidation, quantitation הכניסה) ניתן ליישם פרוטוקול זה בסיסי עוד יותר לנתח את ההשפעה על שכפול נגיפי. שינויים אלו מראים כמה גמיש פרוטוקול זה הוא בנוגע HIV-1 quantitation זיהוי: אכן, גם תקן ה-HIV-1 הפוכה quantitation מבחני transcriptase באמצעות טריטיום שכותרתו נוקלאוטידים מתקבל על הדעת להחליף את ELISA ל-HIV-1 p24. בנוסף MDM, אנו מצפים המערכת שלנו להיות להתאמה סוגי תאים אחרים הנוגעים ל-HIV-1-מלריה אינטראקציות, כגון מונוציטים ותאים דנדריטיים. העובדה MDM הם תאים חסיד מאפשר מניפולציה שלהם, ומאפשר טיפול קל הכביסה מתוך iRBC שלא היה נלקח, או נמצאים בקשר עם MDM, ללא ביטול כל מקרופאגים. יתרון כזה לא יחול על תאים דנדריטים ומונוציטים, אשר בתרבית ההשעיה, שמסבך את SEparation של iRBC uRBC וחופשי עם תאים כאלה ואנחנו כרגע מענה לבעיה זו. המערכת שלנו יכולה להיות שימושית גם כדי לחקור אינטראקציות מורכבות יותר, כגון ההשפעה של Plasmodium-שנחשפו מונוציטים הנגזרות תאים על מחזור נגיפי HIV-1 בתאים חיסוניים אחרים כגון מסוג CD4 חיובי בתאי T של שיתוף תרבות ניסויים. לבסוף, פרוטוקול שלנו יכול להיות מתאים לניסוי מחפש את ההשפעה של פ ' falciparum iRBCs על הפעלה מחדש ב-HIV-1 PBMC ל-HIV-1 אנשים נגועים.

משפט ואתיקה

האדם PBMC התקבלו בדם של תורמים בריאים, בהתאם להנחיות ועדת אתיקה של המרכז הרפואי המרכז דה l'אוניברסיטת מחקר לאוול. הסכמה בכתב התקבל כל תורמי הדם.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי למחקר בריאות דרך Catalyst שיתופי זיהומים ועמיתים נלוות גרנט. אריתרוציטים האדם סופקו על ידי הבנק המרכז הרפואי de l'דם מאוניברסיטת לאוול.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
RPMI 1640 Multicell 350-000-CL
PBS-endotoxin free Sigma D8662
FBS Wisent 080-150 Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
Accutase eBiosciences 00-4555-56
Albumax II Gibco 11021-037 Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized
Lymphocyte separation medium Multicell 305-010-CL
White luminometer plates Promega Z3291
CS Macs separation columms Miltenyi Biotech 130-041-305
VarioMacs separator Miltenyi Biotech 130-090-282
Penicillin/Streptomycin solution Wisent 450-201-EL
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Cell scraper (25 cm) Sarstedt 83.1830
24-Well Cell Culture Plates BD Falcon 353047
150 x 20 mm culture dish Sarstedt 83.1803.003
M-CSF Genscript Z02001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Human serum AB+ Valley Biomedical HP1022
HBSS Wisent 311-505-CL
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9636
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
Luciferase Assay System Promega E1500
Human red blood cells Obtained purified from CHUL blood bank.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. WHO. . World Malaria Report. , (2005).
  2. Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
  3. Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
  4. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
  5. Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
  6. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
  7. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
  8. Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
  9. Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
  10. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  11. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  12. Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
  14. Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
  15. Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
  16. Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).

Tags

In Vitro Co-infection ModelPlasmodium FalciparumHIV-1 InteractionsHuman Primary Monocyte-derived Immune CellsMalariaHIV-1Co-infectionsDisease ProgressionTransmissionImmunological MechanismsSoluble Malarial AntigensHIV-1 InfectionReactivationImmune CellsP. Falciparum Schizont Stage ParasitesPeripheral Blood Mononuclear Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Andreani, G., Gagnon, D., Lodge, R., Tremblay, M. J., Richard, D. An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells. J. Vis. Exp. (66), e4166, doi:10.3791/4166 (2012).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image