<em> В пробирке</em> Ко-инфекция моделью для изучения<em> Plasmodium тропической</em> ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Примечание: Эксперименты с ВИЧ-1 и Plasmodium тропической должны быть выполнены в надлежащем уровня биобезопасности лабораторий (BSL2 для паразитов и BSL3 для ВИЧ-1 и сопутствующих инфекций) и специальные меры предосторожности должны быть приняты при использовании потенциально зараженной крови человека. 1. Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) очистки (на 8 и 9) Начать со свежей человеческой крови здоровых доноров (500 мл), получавших антикоагулянты (гепарин, цитрат, кислота или цитрат декстрозы цитратом фосфата декстрозы). Используйте эндотоксин без реагентов при очистке и изоляции РВМС и на протяжении всего протокола. Лечить кровью мешок, в том числе труб, 70% этанолом, разрезать трубу и аккуратно передавать кровь в T150 колбу. Подготовить 16 труб с 15 мл Разделение лимфоцитов Средний (Ficoll) в 50 мл коническую трубку (чтобы убедиться, что Ficoll до комнатной температуры).Тщательно слой 30 мл свежей крови на вершине. Центрифуга 400 мкг в течение 30 мин при 20 ° С с обрывается. Во время центрифугирования, готовить 8 х 50 мл конические пробирки с 25 мл сбалансированного соль комнатной температуры Хэнка Решение (HBSS) в трубе. Тщательно передать облачно кольцо клетки на уровне интерфейса (содержит МКПК) в 50 мл пробирку, содержащую HBSS (бассейн 2 кольца ячейки в трубку). Заполните объемом до 50 мл HBSS. Центрифуга 150 мкг в течение 15 мин при 20 ° С с перерывами на. Во время центрифугирования облачно кольцо клетки, собирать желтые верхний слой из Ficoll шаг, бассейн плазмы пополнить 50 мл коническую трубку. Деактивировать дополнение в плазме крови при нагревании в 50 мл трубы на 56 ° C в течение 30 мин и спина 10 мин при 1800 х г. Держите супернатант (содержит разбавляют аутологичной плазмы, которые могут быть использованы в качестве добавки в среду поздно шагов). Осторожно удалите супернатант и resuspenг осадок клеток с шагом 1,7 в 25 мл HBSS и бассейн 2 окатышей на 50 мл трубку. Спиновая 300 мкг в течение 8 минут при температуре 20 ° C. Удаляют супернатант тщательно и ресуспендирования гранул в 10 мл HBSS и бассейн в одном 50 мл трубку. Возьмите аликвоту выполнить трипанового синего исключение для оценки смертности, а затем рассчитывать PBMC. Полный объем до 50 мл HBSS и спина 10 минут при 300 х гр. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в RPMI 1640 в 5х10 6 кл / мл (необходимо получить около 400-500 х 10 6 МКПК от 500 мл крови). 2. Моноциты-макрофаги производных (MDM) Дифференциация (на 8 и 9) Семенной приблизительно 1,25 х 10 8 МКПК в 15 см блюда с RPMI 1640 (25 мл / блюдо). Давайте придерживаться клетки в течение 1-2 часов при температуре 37 ° C с 5% CO 2 атмосферы. Передача, не придерживался клеток в новой колбы и промыть пластины с 15 мл эндотоксина без PBS в два раза (5мин, 300 мкг). Придерживаться клетки изолированных моноцитов. Чтобы свежевыделенных моноцитов дифференцироваться в МДМ, добавить 20 мл RPMI 1640 с добавлением 5% аутологичной плазмы (из шага 1.8). Добавить человеческий рекомбинантный макрофаг колониестимулирующий фактор (M-CSF, 25 нг / мл) и пенициллина / стрептомицина решение (PS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина). Выдержите в течение 2 дней, изменение средних и инкубировать 2-3 дополнительных дня при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. Удалите старый средний и промыть эндотоксин без PBS раз, добавьте PBS мягко и аспирации немедленно. Чтобы отключить полностью дифференцирована МДМ, лечить клетками с ~ 7 мл Accutase (Accutase, имеющихся в продаже смесь протеаз и коллагенолитических деятельности, которые позволяют отряд клеток из пластиковой тарелки) в течение 15-20 минут при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы, мягко рок в середине времени. Добавить 3-5 мл аутологичной плазмы (с шагом 1.8) в каждой пластины (для защиты клеток,выскабливание). Аккуратно очистить клетки убедившись, что среда охватывает клетки во все времена и передачи / бассейн в 50 мл трубку. Промыть пластины с эндотоксина без PBS восстановить столько ячеек, сколько возможно. Спином 5 мин при 200 мкг, отказаться от супернатант. Ресуспендируйте гранул в 5 мл МДМ питательной среды (RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной дополнение эмбриональной телячьей сыворотки (IFBS), PS, 25 HEPES мМ) и подсчет клеток (МДМ дают обычно 2-8% от общего числа МКПК). Примечание: аликвоту МДМ могут быть приняты на этом этапе для оценки чистоты популяции клеток с помощью проточной цитометрии, обычно 99% полученных МДМ-экспресс CD14. Семенной 1×10 5 МДМ в 600 мкл МДМ культуральной среде на лунку в 24-луночных планшетах. Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы перед инфекциями. 3. Производство и количественный ВИЧ-1 Вирусные акции Продукция вирусной акции, используя трансфекцию фосфата кальция в клетках HEK293T ФоллоКрыло протокола Фортин и соавт. 10. Для того чтобы получить один цикл, содержащий вирусы люциферазы кодирование гена-репортера, со-трансфекции клеток HEK293T либо 20 мкг NL4.3 Люк + Env – R + и 10 мкг pHCMV-G, или 15 мкг NL4.3 Люк + Env – R + и 15 мкг pJRFL окр. Использование 30 мкг NL4.3 Люк + Env – R + для получения контроля гликопротеин с дефицитом вирусов. Для полного вируса репликативной, использовать 30 мкг NL4.3Bal окр. Векторов pHCMV-G и pJRFL окр кодирования конверт гликопротеинов вируса везикулярного стоматита (VSV-G) и CXCR5-тропные штаммы ВИЧ-1 (отличается от NL4.3Bal ENV), соответственно. Дополнительная информация о плазмиды могут быть получены из 8. Плазмиды могут быть получены через NIH исследований СПИДа и справочные программы (NIAID, NIH). Количественная всех вирусных акций с помощью ИФА на ВИЧ-1, p24 белок капсида 11, И проверить их инфекционным потенциал перед использованием. Мы оцениваем инфекционной наших запасов вируса с помощью ТЗМ-BL индикаторных клеток 12. 4. Культура плазмодии тропической (по 13) 4.1 Общие культуры и обслуживание паразитов Поддерживать P. тропической 3D7 бесполого паразитов этап в эритроцитах человека (группа крови O +) на 4%, гематокрита в RPMI 1640 (буфере с 25 мМ HEPES и 25 мМ NaHCO 3) с добавлением 0,5% (вес / объем) Albumax II, 25 мкг / мл гентамицина и 370μM гипоксантин при 37 ° C в газовой смеси 1% кислорода / 5% углекислого газа в атмосфере азота. Паразитемии можно контролировать, сделав тонкий слой культуры и окрашивание с 15% Гимза решение. Всегда сохранять неинфицированных эритроцитов (УрБК) культуры блюдо в тех же условиях, как паразиты использовать в качестве контроля. Для получения конце parasit этапES (трофозоиты / начале шизонты), синхронизировать паразитов следующим образом: 4,2 паразитов синхронизации Утром, собрать паразитов культуры, спина 5 мин при 300 мкг и отказаться от супернатант. Ресуспендируйте гранулы упакованные в 5 объемах ячейки с 5% (вес / объем) D-сорбит и инкубировать 5 минут при 37 ° C. Спином 5 мин при 300 х г, отказаться от супернатанта Ресуспендируйте гранул в 30 мл культуральной среды и положить обратно в инкубатор. Около 8 часов позже, повторите шаги с 4.2.1 до 4.2.3, чтобы получить тесно синхронизирован паразитов. Поздняя стадия паразитов (трофозоиты / начале шизонты) может быть собран на следующее утро для проведения эксперимента. Перед очисткой, выполняют Гимза окрашивания, чтобы подтвердить этапов жизненного цикла. 4,3 Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец (iRBC) очистка Стерилизовать сепаратор VarioMacs (в режиме ожидания и магнит) с 70% этанола и ркружева под биологических капотом. Закрепите трехходового крана вниз колонка CS. Отрежьте конец иглы защитник пластика с Miltenyi специальный резак и закрепить иглу на дно краном. Закрепить столбец в магнит тщательно. Удалите все пузырьки воздуха в колонке медленно инъекционные 10 мл питательной среды MDM с комплектом корпусе шприца привинчен слева от крана. Промойте колонку с ~ 20 мл питательной среды MDM. Урожай РБК от культуры плиты, мыть один раз 10 мл МДМ среднего (300 мкг, 5 мин) и ресуспендирования РБК гранул в 12 мл культуральной среды MDM. Постепенно добавить к колонке, и пусть подвески потока через (только зараженные эритроциты крови, содержащей паразитов в трофозоита или шизонт этапе будут сохранены с помощью магнитного поля в связи с наличием кристаллов hemozoin). Промыть раз с 20 мл среды и остановить поток жидкости, когда она достигает белый диск на вершине колонны. Удалите столбец из магнита и элюируются iRBC в чистую стерильную пробирку с 12 мл питательной среды MDM. Мазок аликвоту восстановленные iRBC и выполнять Гимза окрашивания, чтобы подтвердить этапов жизненного цикла. Граф восстановления iRBC помощью гемоцитометра (изолированные РБК на 100% iRBC). Гранул клеток (300 мкг, 5 мин), супернатант отказаться и лечения клеток с 500 мкл свежей AB + сыворотки крови человека (opsonisation шаг 14). Инкубировать 30 мин при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. Мыть раз в 10 мл культуральной среды MDM (300 х г, 5 мин), и ресуспендируют iRBC в нужной концентрации. Как правило, 10% паразитемии 15 см культуры блюдо дает примерно ~ 0.5-1×10 8 жестко синхронизированы iRBC. 5. Воздействие МДМ Plasmodium тропической Чтобы разоблачить МДМ УрБК или iRBC, клетки должны быть ресуспендируют в культуральной среде, МДМ, чтобы получить соотношение УрБК / iRBC: МДМ 75:1. В ранееподготовленный 24-луночных содержащей МДМ, добавить соответствующие подвески РБК объем в каждую лунку. Выполните все эксперименты в трех экземплярах. Инкубируйте совместно культур в течение 4 часов при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. Промойте клетки с 600 мкл эндотоксина без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно. Лизировать оставшиеся РБК, промыть лунки, добавляя 200 мл ледяной стерильной водой в течение 20 сек и аспирации. Добавить 600 мкл культуральной среды MDM и инкубировать 24 часа при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. 6. Инфекция с МДМ Полностью репликативной ВИЧ-1 Для того, чтобы оценить влияние П. тропической по репликации ВИЧ-1 в МДМ, добавим, согласно схеме, изложенной в рис. 1А, 10 нг p24 (в 300 мкл МДМ-СМИ) NL4.3Bal вирусов окр в соответствующие лунки, добавить только МДМ-среды в управление скважин . Инкубировать 2 часа при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Промойте клетки эндотоксин без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно. Добавить 600 мкл свежей среды MDM на лунку. Инкубировать при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. В дни 3, 6, 9 и 12 после начала вирусной инфекции, урожай 200 мкл каждого супернатанта, добавив 200 мкл свежей среды MDM в дальнейшем. Хранить собранных супернатантах при температуре -20 ° С для количественного определения основных ВИЧ-1 капсида p24 белка ИФА после Фортин и соавт. 10. 7. Заражение МДМ с одиночной люциферазы вирусов Кодирование цикла Для того чтобы определить влияние паразита на ВИЧ-1 экспрессии генов в МДМ, добавим, согласно схеме, изложенной на рисунке 1В, 10 нг p24 (в 300 мкл среды MDM) либо NL4.3 Люк + Env – R + ( VSV-G), NL4.3 Люк + Env – R + (JRFL ENV) или NL4.3 Люк +Env – R + вирусы в соответствующие лунки. Инкубировать 2 часа при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. Промойте клетки с 600 мкл эндотоксина без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно. Добавить 600 мкл свежей среды MDM на лунку. Инкубировать при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. Удалите среду 72 часа после инфицирования и добавить 200 мкл лизирующего буфера 1X (поставляется вместе с комплектом люциферазы анализ). Пусть лизировать клетки при комнатной температуре с нежным тряски. Хранить при температуре -20 ° C. Таяние пластины и передать 40 мкл лизата на 96 лунок люминометра пластины, добавить 100 мкл субстрат люциферазы (поставляется вместе с комплектом люциферазы анализ) и измерить люциферазы (Firefly люциферазы) деятельность в люминометра в соответствии с инструкциями производителя. 8. Представитель Результаты Используя наш ко-инфекции модели, мы покажем, что exposurе П. тропической МДМ снижает их восприимчивость к ВИЧ-1 инфекции. Действительно, значительное снижение (р <0,05, 2 дисперсионного анализа, 12-й день) в выпуске вирусных частиц, измеряемая ВИЧ-1, p24 белок капсида в супернатанте, наблюдается в МДМ предварительно с паразитами (рис. 2A). Это наблюдение подтверждается в клетках, инфицированных вирусами кодирования люциферазы-ген-репортер. МДМ-инфекции с такими вирусами укрывательство или экзогенных VSV-G или ВИЧ-1 гликопротеинов приводит к достоверно (р <0,05, Стьюдента-тест) меньше люциферазы в клетках подвергаются P. тропической (рис. 2В). Стоит отметить, что VSV-G-pseudotyped вирусов дали гораздо больше активности люциферазы, чем их коллеги JRFLenv, это связано с большей эффективностью инфекции VSV-G pseudotyped частиц 15. Учитывая, что паразит экспозиции МДМ последствия обоих типов вирусов, это говорит о том, что он влияет на каком-то шаге вирусной бывший генВыражение (рис. 2В). Важно также отметить, что жизнеспособность клеток не зависит от МДМ-экспозиция iRBC (данные не представлены), что указывает на торможение наблюдается является специфическим и не за счет клетки смертности. Рисунок 1. А) плиты схему МДМ-инфекции вирус полностью репликативной Мок. Неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец. Баль: клетки, инфицированные NL4.3Bal окр Бал / УрБК. Клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3Bal окр Бал / iRBC.. Клетки подвергаются iRBC и инфицированных с NL4.3Bal окр б) плиты схему МДМ-инфекции один цикл люциферазы кодировки вирусов Мок. неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-яnfected красных кровяных телец. Δenv: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env – R + JRFL. Клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env – R + (JRFL ENV). VSV-G: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env – R + (VSV-G) Δenv / УрБК.. клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env-R + Δenv / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env – R + JRFL / УрБК: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env – R + (JRFL ENV).. JRFL / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env – R + (JRFL ENV). vsv-g/uRBC: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env – R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env – R + (VSV-г). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> Рисунок 2. .) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной продукции в МДМ МДМ подвергались УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC: MDM) в течение 4 часов и широко мыть. Клетки были заражены 10ng из NL4.3Bal окр p24 в течение 2 часов. Вирусный производство контролировалось с помощью ИФА на ВИЧ-1, p24 в бесклеточной надосадочной в различные моменты времени после первоначального вирусной инфекции. Представитель эксперимент показал B) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной транскрипции в МДМ МДМ были инфицированы УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC.. MDM). Затем клетки, инфицированные 10ng р24 одного цикла вируса (или NL4.3 Люк + Env – R +, NL4.3 Люк + Env – R + (JRFL ENV) или NL4.3 Люк + Env – R + (VSV- г)). Люциферазы выражении оценивалась в клеточных лизатов 72 часа после заражения вирусом. Представитель эксперимента.