En detaljert beskrivelse av mus holme isolasjon er beskrevet ved hjelp av teknikken i plasstøpt bukspyttkjertelen duktalt kanylering og perfusjon av en kombinasjon av renset kollagenase og nøytral protease.
Avhøret av beta celle genuttrykk og funksjon in vitro har holdent skiftet gjennom årene fra studien av gnager tumorigene cellelinjer til studiet av isolerte gnager holmer. Primære holmer tilby klar fordel at de mer trofast reflekterer biologi intracellulære signalveier og sekretoriske svar. Mens fremgangsmåten ifølge holmen isolasjon ved hjelp av vev dissociating enzyme (TDE) preparater har blitt godt etablert i mange laboratorier 1-4, variasjoner i konsistensen av holmen avkastning og kvalitet fra enhver gnager belastning begrense omfanget og gjennomførbarheten av primære holme studier. Disse variasjonene oppstår ofte som et resultat av det urene delvis rensede TDEs brukes i holmen isolasjon prosedyren; TDEs oppviser ofte varen til lot variasjoner i aktivitet og krever ofte justeringer dosen av enzym som brukes. Et lite antall rapporter har brukt renset TDEs for gnagere celle isoleringer 5, 6 </sup>, men praksisen er ikke utbredt til tross for rutinemessig bruk og fordeler av renset TDEs for menneskelige holme isoleringer. I samarbeid med VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), har vi utviklet en modifisert mus holme isolasjon protokoll basert på den som er beskrevet med 7 Gotoh, 8, der TDEs blir perfused direkte inn bukspyttkjertelen duct av mus, etterfulgt av råolje vev fraksjonering gjennom en Histopaque gradient 9, og isolering av renset holmer. En signifikant forskjell i protokoll vårt er bruken av renset kollagenase (CI Zyme MA) og nøytral protease (CI Zyme BP) kombinasjon. Den collagenase ble karakterisert ved bruk av en 6 fluorescens kollagen nedverdigende aktivitet (CDA) analyse som benyttes fluorescensmerkede oppløselige kalveskinn fibriller som substrat 6. Dette substratet er mer prediktivt for kinetikken av kollagen degradering i vev matrise fordi den er avhengig innfødt kollagen som substrat. Proteasen var characterized med en følsom fluorescerende kinetisk analyse 10. Utnytte disse bedre analyser sammen med mer tradisjonelle biokjemisk analyse aktivere TDE skal produseres mer konsekvent, noe som fører til bedre ytelse konsistens mellom partier. Protokollen er beskrevet her er optimalisert for maksimal holme avkastning og optimal holme morfologi med C57BL / 6 mus. Under utviklingen av denne protokollen, ble flere kombinasjoner av collagenase og nøytrale proteaser vurderes på ulike konsentrasjoner, og den endelige forholdet collagenase: nøytral protease av 35:10 representerer enzym ytelse sammenlignes med Sigma Type XI. Fordi betydelig variasjon i gjennomsnittlig holme avkastningen fra ulike stammer av rotter og mus har blitt rapportert, bør ytterligere modifikasjoner av TDE sammensetning gjøres for å forbedre ytelse og kvalitet av holmer utvinnes fra ulike arter og stammer.
I denne protokollen, har vi beskrevet våre prosedyre for kanylering, collagenase perfusjon, og dissosiasjon av murine bukspyttkjertelen, med mål om å isolere holmer av Langerhans. Teknisk, vår metode, når mestret, bør tillate bukspyttkjertelen isolasjon innen 4 minutter av euthanizing dyret, og etter 1 time bør resultere i isolering av holmer fra et enkelt dyr. Hurtigheten av teknikken tillater oss å isolere holmer fra opptil 12 mus ved en typisk strekk, og dermed resulterer i isoleringen av opptil 3000 holmer.
I motsetning til andre protokoller som bruker råolje preparater av collagenase, har vår protokoll bruk av renset proteaser, CI Zyme kollagenase MA og CI Zyme BP Protease. Variasjoner i konsistensen av TDE preparater som er kommersielt tilgjengelig krever at hvert parti individuelt testet og optimalisert før generell bruk. Dette lot til mye variasjon førte oss til å vurdere bruk av puriModifiserte TDEs fra VitaCyte. Disse høyt rensede TDEs kjennetegnes ved flere metoder inkludert bruk av sensitive fluorescence merket substrat-analyser. Fluorescensen CDA-analysen er mer følsomme for ulike molekylære former av kollagenase som har forskjellige kinetikk i nedverdigende innfødt kollagen. Historisk peptid underlaget analyser gir en ufullstendig vurdering av collagenase. Karakterisere collagenase av flere metoder sikrer større enzymaktivitet mellom mange.
Basert på vår in-house testing ved hjelp av en rekke kollagenase forberedelser kommersielt tilgjengelig, fant vi ut at de rensede enzymet kombinasjoner ga reproduserbare lot til lot resultater. De store fordelene ved å bruke svært renset og grundig karakterisert TDEs i denne søknaden er når optimal enzympreparat er definert, blir lot til lot ytelse konsistens trygg. Dette konsistens eliminerer arbeidskrevende prosess for mye kvalifisering normalt krevesfor råolje eller beriket kollagenase produkter. Rensede TDEs også aktivere flere modifikasjoner av preparatet for å forbedre utbytte og kvalitet av holmer utvinnes fra forskjellige musestammer. Rapportering optimale enzym preparater for isolering av holmer fra forskjellige stammer av mus kan være mer effektivt kommunisert. Dette i sin tur fører til mer produktiv bruk av ressurser og bedre fleksibilitet i eksperimentell design.
Det er mange viktige skritt som kan påvirke utfallet av holmen isoleringer ved hjelp av vår protokoll. Den første er behovet for å oppnå en effektiv oppblåsing av bukspyttkjertelen under perfusjon av enzympreparatet. Det er viktig å starte inflasjon med skånsom kraft på sprøyten, og øke kraften som bukspyttkjertelen blåses. Det er nyttig å flytte tarmen og løft bukspyttkjertelen under oppblåsning, slik at kollagenase perfuses hele organ. En annen kritisk trinn er den kraft med hvilken en vibrering rørene after inkubering ved 37 ° C (trinn 2.2). Vi har funnet at risting bukspyttkjertelen hardt mot hetten av røret forårsaker fragmentering av holmer, men uten noen form for mekanisk dissosiasjon på dette trinnet, kan holmen utbytter falle dramatisk. Det er også viktig at under dissosiasjon trinnet med sprøyten (trinn 2.5), er en middels nivå kraften under opp-og ned bevegelse med stempelet, og dette sikrer tilstrekkelig vev dissosiasjon før filtreringen trinn (2.6), der det er svært lite vev bør beholdes på tesil filteret. Endelig, er det siste trinnet for å følge nøye aspirasjon av hele 20 ml av de histopaque fraksjonerte holmer. Selv holmer er vanligvis på grensesnittet til histopaque og HBSS, har vi funnet ut at vi mister holmer når vi prøver å fjerne bare grensesnittet, i stedet har vi nå fjerne hele 20 ml med en stor bar 25 ml pipette. Vi lagt filtrering gjennom inverterte 70 mikrometer filter (trinn 2.11) for å eliminere behovet for å centrifuge holmer gjentatte ganger for å vaske bort histopaque.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd DK060581 R01, R01 DK083583 (både RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |