Mus Islet af Langerhans Isolation ved hjælp af en kombination af renset collagenase og Neutral Protease

A. Nødvendige materialer: Se tabel 1 (reagenser) før tilberedning HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% penicillin / streptomycin (opbevares i køleskab eller opbevares på is). 20% BSA stock fremstilles i vand og alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endelige koncentrationer på 0,3%) Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamin + 1% penicillin / streptomycin Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque 4-0 Sutur (McKesson): skåret i 2 ¾ cm stykker og opbevaret i en 10 cm petriskål Instrumenter: Bøj tangen fra fin Science Tools til 90 °, og fil ned de takkede tænder af alle tre par af tang. Målet er at sløve tænderne, ikke at fjerne dem. Tungeholder til administration af collagenase / protease blanding: 27G ½ i. nål, 30 ½ i.nål, PE50 rør skæres i 12 in stykker. Fil begge nåle ned til en glat afrundet ende, som ikke har nogen skarpe kanter. Sæt 27G nål i den ene ende af en 12 tommer stykke PE50 rør. Fjern 30G nål fra huset ved at smadre huset med en tang, dreje huset ¼ drej hver gang. Fjern nålen med tang fra huset, og sæt det ind i den anden ende af PE50 rør under en dissektion mikroskop. Vær sikker på at ikke knækkes slangen, når du sætter nålen i PE50 rør. Den 27G nål er slutningen, at du vil vedhæfte sprøjten af ​​collagenase. Collagenase (CI liserede enzym MA) og Neutral Protease (CI liserede enzym BP). Opløs TDE ifølge producentens anvisninger. Der henvises til partiet specifikke Certificate of Analysis at beregne enzymaktiviteten koncentration. Overfør i alt 350.000 collagen nedbrydende aktivitet (CDA) enheder af den rekonstituerede collagenase og 100.000 neutral protease enheder af reconstitudloddet BP Protease til et konisk rør, og der fortyndes til 15 ml i alt i HBSS (P / S) B. Step-by-Step protokol 1. Oppustning af Pancreas med collagenase / Protease Blanding Aflive mus ved cervical dislokation, mætte muse torso med 70% EtOH, åbne bughulen helt fra anus til membranen med eventuelle dissektion saks og pincet. Placer musen på platformen af ​​en dissektion mikroskop. Træk caecum og colon ascendens ud og sætte dem uden for kroppen hulrum til venstre. Se figur 1 for en oversigt over de følgende trin. Placere fligene i leveren mod membranen, og de skal forblive der, hvis kropskaviteten er åben langt nok. Find den hepatiske arterie, portal vene og galdegang bundt fører ind i leveren ved at tage fat i duodenum med buede pincet. Med et andet par krumme pincet, når under arterie, vene, og kanalen bundle og træk en 2 ¾ i. stykke 4-0 sutur under arterie, vene, galdegang og binde det én gang og stram den så tæt på leveren som muligt. Ved hjælp af to par buede pincet, forsigtigt fat i duodenum og finde galdegang fastgjort til duodenum ved papilla. Brug en tang af pincet til at stikke gennem bugspytkirtlen og bindevæv lige under galdegang tæt på papilla. Poke dine pincet hurtigt gennem organ at lave et hul og derefter sætte begge tænger af tang igennem og få fat i en anden 2 ¾ tomme stykke 4-0 sutur gennem og binde det én gang og trække den til en lille kreds, men IKKE træk sammen. Skift til de 90 ° pincet og til Superfine Vannas saks. Med de 90 ° pincet, klemmes forsigtigt og træk tyndtarmen, indtil galdegang er stram. Gør én vandret snit på tværs af papilla med saksen ved at stikke de åbne saks ind i tarmen og derefter skære med én bevægelse. Prøv at kun gøre one går på tværs af papilla uden løs galdegang fra papilla. Mens du stadig holder tarmen med de 90 ° pincet, skal du indsætte kanylen ind i galdegangen op til halvdelen af ​​længden af ​​galdegang, og træk derefter forsigtigt sutur stramt omkring kanylen. Fyld en 3 ml sprøjte med 2,0 ml collagenase / protease blanding og indsprøjtes i kanylen ved en langsom, konstant hastighed. Efter oppustning af pancreas er afsluttet, fjernes kanylen fra galdegangen og bruge de buede pincet og buede fjeder saks til at fjerne den oppustede pancreas ved at starte den nedadgående kolon og snipping bindevævet, som man trækker tarmene op. Fortsæt med at fjerne bugspytkirtlen fra tarmene, indtil du når galdegang, og fjern derefter bugspytkirtlen fra milten, så maven og derefter fra indvoldene af bughulen. Afslut fjernelse ved at klippe væk suturerne. Tilsæt pancreas til et 50 ml rør indeholdende 5 ml HBSS(P / S). Dette rør skal være på is. Gentage proceduren ovenfor for hvert dyr op til fire dyr. For at opnå optimale resultater, dissocierer kun fire pancreas på én gang. Typisk, medens de første fire er i 37 ° C vandbad, vi oppustning yderligere fire pancreas. 2. Pancreas Dissociation Placere 50 ml rør indeholdende pancreas til et 37 ° C vandbad i 15 min. Vip forsigtigt glasset og tjek for væv dissociation, skal du sørge væv kommer let fra hinanden, så hvirvel rørene 12 gange, mens du holder røret af låget. Tilføj ikke mere end 30 ml HBSS (BSA) (dette kan være et lavere beløb, afhængigt af hvor meget skal afveje rørene for centrifugeringstrin), og centrifuger ved 290 xg for én min. Aspirer supernatanten forsigtigt og efterlade en lille mængde supernatant (2-3 ml) ved bunden, således at ikke forstyrre cellepelleten. Anvendelse af en 30 ml sprøjte Attached til 14G nål, tilføje højst 10 ml HBSS (BSA), og der opsuges suspensionen op og ned 2 gange. Filtrere celleblandingen via en plast tesi i et 50 ml rør og skylles med en anden 10 ml HBSS (BSA). Centrifuger ved 330 x g i 2 min. Dekanter supernatanten og vendes rør til at dræne på en absorberende papirserviet i 1 min. Resuspender hvert rør i 10 ml kold 1100 HISTOPAQUE. Overlejrer HISTOPAQUE med 10 ml HBSS (BSA) og centrifuger ved 900 x g i 18 min. Fjerne hele 20 ml supernatant under anvendelse af en stor boring 25 ml pipette og passerer supernatanten gennem en omvendt 70 um filter. Skyl holme i en 10 cm petriskål ved pipettering 10 ml ø-medier gennem filteret, mens du holder den højre side op over skålen. Kultur øerne i en 37 ° C, 5% CO2 vævsdyrkningsinkubator indtil den er klar til forsøg. Typisk er holme håndplukket og talt før experimentation. 3. Repræsentative resultater Islet udbytter, morfologi, og kvalitet er de generelle parametre, der anvendes til at bedømme succesen af ​​ø isolation. I vores hænder, er ø-udbytter fra det gennemsnitlige C57BL / 6 mus i intervallet 150-250 holme ved hjælp af denne protokol (se tabel 2), og er sammenlignelige med data indsamlet ved hjælp af optimeret Sigma type XI collagenase. Imidlertid kan udbyttet variere afhængigt af musen anvendte stamme og alder musen. De fleste af de dyr, vi anvender, er i 8-16 uger aldersgruppe Denne protokol er blevet testet på flere musestammer, herunder C57BL / 6 (180-250 øer / mus), CD1 (200-300 øer / mus), 129 / B6 (200-300 øer / mus), BLKS-db/db (120-200 øer / mus), NOD (10 uger gamle, 100-150 øer / mus) og NOD-SCID (100-150 øer / mus ). Typisk ø-morfologi er vist i figur 2, i hvilken øer har en rund til aflang tablet med forholdsvis ensartet størrelse (selv om størrelsen uniformity kan variere fra stamme til stamme). Figur 3 viser vores typisk analyse af glucose-stimuleret insulinsekretion fra C57BL / 6 mus isolerede øer anvendelse af oprensede TDES vs Sigma Type XI collagenase. Typisk er en høj kvalitet ø forberedelse resulterer i en insulinstimulering med 25 mM glucose, der er 6-20 gange større end ved 2,5 mM glucose. Andre anvendelser kan også anvendes til at teste kvaliteten af isolerede øer, og disse indbefatter anvendelse af perifusion teknikker, Ca2 + billeddannelse (med fura2), og revers transskription PCR, bl.a. 11. Figur 1. En sammenfatning af kanylering af galdegangen. Figur 2. Typisk udseende af C57BL / 6 holme ved 24 HR efter isolation. Billederne blev optaget på et inomsættes mikroskop ved 40X forstørrelse. Figur 3. Glucose-stimuleret insulinsekretion i C57BL / 6 øvævsceller. Ved 24 timer efter isolering, blev 100 øvævsceller inkuberet i en 12-brønds skål i 1 time ved 37 ° C i Krebs-Ringer HEPES-pufret opløsning indeholdende 2,5 mM glucose. Øvævsceller blev herefter overført til Krebs-Ringer HEPES ved 2,5 mM glucose i yderligere time, hvorefter supernatanten blev opsamlet for insulin måling under anvendelse af et to-site immunspecifikke enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) (Crystal Chem). De samme øvævsceller blev efterfølgende overført til Krebs-Ringer HEPES-pufret opløsning indeholdende 25 mM glucose, og insulin i mediet blev målt ved ELISA efter 1 timers inkubation.