الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة
Summary
يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.
Abstract
تحول الاستجواب من خلية بيتا التعبير الجيني وظيفة مباشرة في المختبر على مر السنين من دراسة خطوط القوارض الخلية مكون للأورام لدراسة الجزر المعزولة القوارض. الجزر الرئيسية تقدم ميزة واضحة أنهم أكثر بأمانة تعكس مسارات إشارات بيولوجية الخلايا الإفرازية والردود. في حين تم طريقة العزل باستخدام الأنسجة جزيرة الانفصال انزيم (TDE) الاستعدادات راسخة في العديد من المختبرات 1-4، الاختلافات في اتساق وجودة محصول جزيرة من أي سلالة القوارض نظرا تحد من مدى جدوى ودراسات جزيرة الأولية. هذه الاختلافات غالبا ما تحدث نتيجة لتنقية الخام TDEs جزئيا المستخدمة في إجراء العزل جزيرة؛ TDEs يحمل في كثير من الأحيان إلى الكثير الكثير الاختلافات في النشاط وغالبا ما تتطلب إدخال تعديلات على جرعة من الانزيم المستخدمة. وقد استخدم عدد قليل من التقارير عن العزلة TDEs تنقية الخلايا القوارض 5 و 6 </suف>، ولكن هذه الممارسة تتعرض لنطاق واسع على الرغم من الاستخدام الروتيني ومزايا تنقية TDEs للجزيرة العزلة الإنسان. بالتعاون مع VitaCyte، LLC (إنديانابوليس، IN)، وضعنا الماوس جزيرة تعديل بروتوكول العزلة على أساس تلك التي وصفها Gotoh 7 و 8، والتي هي في perfused TDEs مباشرة في قناة البنكرياس من الفئران، تليها تجزئة النسيج الخام عبر التدرج Histopaque 9، وعزل تنقية الجزر. اختلاف كبير في بروتوكول لدينا هو استخدام كولاجيناز المطهرون (CI إنزيم MA) ومحايد الجمع البروتيني (CI إنزيم BP). تميزت كولاجيناز من استخدام الكولاجين مضان 6 المهينة مقايسة (CDA) النشاط التي تستخدم fluorescently المسمى الجلد العجل للذوبان الألياف والركيزة 6. هذه الركيزة هو أكثر التنبؤية لحركية تدهور الكولاجين في المصفوفة الأنسجة لأنها تعتمد على الكولاجين الأصليين الركيزة. كان الفصل البروتينيaracterized مع مقايسة الحساسة الحركية الفلورسنت 10. الاستفادة من هذه المقايسات تحسين جنبا إلى جنب مع التحليل الكيميائية الحيوية التقليدية تمكن من تصنيع TDE أكثر اتساقا، مما يؤدي إلى تحسين الأداء الاتساق بين الكثير. على النحو الأمثل وصفها في البروتوكول هنا للجزيرة الغلة القصوى والمثلى باستخدام التشكل جزيرة C57BL / الفئران 6. خلال تطوير هذا البروتوكول، وتم تقييم مجموعات عديدة من كولاجيناز والبروتياز محايدة في تركيزات مختلفة، ونسبة النهائية للكولاجيناز: البروتيني محايدة من يمثل أداء الإنزيم 35:10 مماثلة لنوع سيغما الحادي عشر. لأن تم الإبلاغ تقلب عوائد كبيرة في جزيرة المتوسط من سلالات مختلفة من الجرذان والفئران، ينبغي إجراء تعديلات إضافية للتكوين TDE لتحسين المحصول ونوعية الجزر تعافى من مختلف الأنواع والسلالات.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول، ووصف الإجراء نحن لدينا لكيفية تركيب الكانيولا، نضح كولاجيناز، والتفكك في البنكرياس الفئران، بهدف عزل جزر لانجرهانز. من الناحية الفنية، لدينا وسيلة، يتقن مرة واحدة، يجب أن تسمح لعزل البنكرياس في غضون 4 دقائق من euthanizing الحيوان، و1 ساعة ينبغي أن يؤدي إلى عزل الجزر من حيوان واحد. سرعة هذه التقنية تسمح لنا لعزل الجزر من الفئران تصل إلى 12 في امتداد نموذجية، مما يؤدي إلى عزلة تصل إلى 3،000 الجزر.
على عكس غيرها من البروتوكولات التي تستخدم الاستعدادات الخام من كولاجيناز، بروتوكول لدينا ميزات استخدام البروتياز تنقيته، CI إنزيم MA collagenase وCI البروتياز BP إنزيم. الاختلافات في اتساق الاستعدادات TDE المتوفرة تجاريا يتطلب أن يتم اختبار كل على حدة الكثير والأمثل قبل استخدام العام. أدى هذا التغير إلى الكثير الكثير منا النظر في استخدام بوريfied TDEs من VitaCyte. وتتميز هذه TDEs عالي النقاء من أساليب متعددة بما في ذلك استخدام المقايسات الحساسة مضان الركيزة المسمى. الفحص CDA الاستشعاع أكثر حساسية لأشكال مختلفة من كولاجيناز الجزيئية التي لها حركية مختلفة في الكولاجين الأصلية المهينة. المقايسات التاريخية الركيزة الببتيد تقديم تقييم غير مكتملة من كولاجيناز. تميز كولاجيناز بواسطة أساليب متعددة تضمن أكبر نشاط انزيم بين الكثير.
على أساس الاختبار في منزلنا باستخدام مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية كولاجيناز المتاحة تجاريا، وجدنا أن الانزيم المنقى تركيبات أسفرت استنساخه الكثير إلى الكثير نتائج. ومرة واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام TDEs عالي النقاء ويتميز بدقة في هذا الطلب تكوين انزيم يعرف الأمثل، وأكد على اتساق أداء الكثير إلى الكثير. هذا الاتساق يلغي عملية كثيفة العمالة التأهيل المطلوبة عادة الكثيركولاجيناز للمنتجات الخام أو المخصب. TDEs المنقى أيضا تمكين تعديلات إضافية للتكوين من أجل تحسين الإنتاجية ونوعية الجزر تعافى من سلالات الفئران مختلفة. يمكن الإبلاغ التراكيب انزيم الأمثل لعزل الجزر من سلالات مختلفة من الفئران يكون أكثر فعالية إبلاغها. وهذا، بدوره، يؤدي إلى استخدام أكثر إنتاجية للموارد وتحسين المرونة في التصميم التجريبي.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على نتائج جزيرة العزلة باستخدام بروتوكول دينا. الأول هو الحاجة إلى تحقيق التضخم فعالة في البنكرياس خلال نضح من تحضير الانزيم. من المهم أن تبدأ التضخم بقوة لطيف على الحقنة، وزيادة القوة وعن انتفاخ البنكرياس. ومن المفيد لتحريك الأمعاء والبنكرياس خلال رفع التضخم بحيث كولاجيناز perfuses الجهاز بأكمله. خطوة حاسمة أخرى هي القوة مع أي واحد يهز بعد عملية الشراء أنابيبص الحضانة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 2.2). لقد وجدنا أن تهز البنكرياس الثابت ضد غطاء للأنبوب يسبب تفتت الجزر، ولكن من دون أي شكل من أشكال التفكك الميكانيكية في هذه الخطوة، والمحاصيل يمكن أن تقع جزيرة بشكل كبير. ومن الضروري أيضا أن الخطوة خلال التفكك مع حقنة (الخطوة 2.5)، يتم تطبيق قوة متوسطة المستوى خلال الحركة صعودا وهبوطا مع المكبس، وهذا يضمن كافية التفكك الأنسجة قبل الخطوة تصفية (2.6)، حيث القليل جدا ينبغي الإبقاء على الأنسجة الشاي تصفية مصفاة. وأخيرا، فإن الخطوة الأخيرة لمتابعة بعناية هو ما تصبو إليه 20 مل كامل من الجزر ومجزأة histopaque. على الرغم من أن الجزر وعادة ما تكون في واجهة من وhistopaque HBSS، وجدنا أن نفقد الجزر عندما نحاول إزالة واجهة فقط، بدلا من ذلك، ونحن الآن إزالة كامل 20 مل باستخدام الماصة كبيرة تحمل 25 مل. واضاف نحن في الترشيح من خلال فلتر مقلوب ميكرون 70 (الخطوة 2.11) للقضاء على الحاجة إلى Centrifuge الجزر مرارا وتكرارا ليغسل histopaque.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في جزء منح R01 DK060581، R01 DK083583 (على حد سواء لRGM).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
Referências
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O’Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
