Vi beskriver en fremgangsmåde til affinitets-taggede oprensning af rekombinante proteiner ved hjælp af væske-handling robot. Denne metode er generelt anvendelig for små oprensning af opløselige His-mærkede proteiner i en high-throughput format.
Røntgenkrystallografi er den foretrukne metode til opnåelse af en detaljeret afbildning af strukturen af proteiner. Sådanne undersøgelser skal suppleres med yderligere biokemiske analyser for at opnå detaljeret indsigt i struktur / funktion relationer. Fremskridt inden for oligonucleotid-og gensyntese teknologi gør omfattende mutagenese strategier stadig mere realistisk, herunder substitution af målrester med alle 19 andre aminosyrer. Gain-eller tab af funktion fænotyper derefter give systematiske konklusioner, såsom bidrag især rester til katalytisk aktivitet, protein stabilitet og / eller protein-protein interaktion specificitet.
For at tillægge de forskellige fænotyper til arten af mutationen – i stedet for svingende forsøgsbetingelser – det er nødvendigt at oprense og analysere proteinerne på kontrolleret og reproducerbar måde. High-throughput strategier og automatisering af manuelle protokoller pårobot væske-handling platforme har skabt muligheder for at udføre sådanne komplekse molekylærbiologiske procedurer med lidt menneskelig indgriben og minimale fejlprocenter 1-5.
Her præsenteres en generel fremgangsmåde til oprensning af His-mærkede rekombinante proteiner i en high-throughput måde. I en nylig undersøgelse, anvendte vi denne metode til en detaljeret struktur-funktion undersøgelse af TFIIB, en del af den basale transkription maskiner. TFIIB er uundværlig for promotor-rettet transkription in vitro og er afgørende for rekruttering af RNA-polymerase i en preinitiation kompleks 6-8. TFIIB indeholder en fleksibel linker domæne, der gennemtrænger det aktive sted kløft RNA-polymerase 9-11. Denne linker domæne giver to biokemisk kvantificerbare aktiviteter på TFIIB, nemlig (i) stimulering af den katalytiske aktivitet under 'mislykkede' etape af udskrift indvielse, og (ii) et supplerende bidrag tilspecifik rekruttering af RNA-polymerase til preinitiation komplekse 4,5,12. Vi udnyttede high-throughput rensningsmetode at generere enkelt, dobbelt og tredobbelt substitution og deletioner mutationer i TFIIB linker og derefter analysere dem med funktionelle assays for deres stimulerende virkning på den katalytiske aktivitet af RNA-polymerase 4. Samlet set genererede vi, oprenset og analyseret 381 mutanter – en opgave, som ville have været tidskrævende og besværlig at udføre manuelt. Vi producerede og analyseret proteinerne i multiplicates som tilladt os at sætte pris på eventuelle eksperimentelle variationer og gav os en klar idé om reproducerbarheden af vores resultater.
Denne metode tjener som et generisk protokol til oprensning af His-mærkede proteiner, og er med succes blevet anvendt til at oprense andre rekombinante proteiner. Det er i øjeblikket optimeret til oprensning af 24 proteiner, men kan tilpasses til at rense op til 96 proteiner.
Den automatiserede rekombinante proteinoprensning her beskrevne fremgangsmåde muliggør fremstilling og oprensning af et stort antal mutante proteiner i et mindre format under stærkt reproducerbare betingelser med minimal menneskelig indgriben. Figur 1 og 2 viser resultaterne af systematiske kvalitets-kontroller og eksempler på den oprensede proteiner. Figur 3 viser, at de oprensede transkriptionsfaktorer anvendt i dette eksempel udføres på en meget reproducerbar måde i funktionelle assays.
Selv om fremgangsmåden blev udviklet til rensning af archaeal TFIIB, er bredt anvendelig til oprensning af affinitets-mærkede proteiner. Anvendelsen af sådanne automatiserede oprensningsprotokoller vil således i væsentlig grad lette biokemisk analyse af rekombinante proteiner og vil således fremme vores forståelse af protein-protein interaktioner i et omfang, der er vanskelig at opnå manuelt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) til ROJW
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
NaCl | VWR | 27810.295 | |
Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |