En parasit-rednings-og transformationsassay med THP1 inficerede celler<em> In vitro</em> Med<em> Leishmania donovani</em> Er blevet optimeret til anti-leishmanial lægemiddel screening. Analysen omfatter differentiering af THP1 celler, infektion med promastigoter, behandling med testlægemidlerne, kontrolleret lysis af de inficerede makrofager, redning af amastigoter, transformation til promastigoter og overvågning promastigote vækst og proliferation med en fluorometrisk analyse.
Leishmaniasis er en af verdens mest oversete sygdomme, hovedsagelig rammer de fattigste af de fattige, især i udviklingslandene. Over 350 millioner mennesker er der risiko for at pådrage leishmaniasis, og cirka 2 millioner nye tilfælde forekommer hvert år 1. Leishmania donovani, er det kausative middel for visceral leishmaniasis (VL), den mest dødelige form af sygdommen. Valget af medicin til rådighed til behandling af leishmaniasis er begrænset 2; nuværende behandlinger giver begrænset effekt, og mange er giftige ved terapeutiske doser. Desuden har de fleste af den første linie behandling narkotika allerede mistet deres anvendelighed som følge af stigende blandingsmisbrug modstand 3. Den nuværende pipeline af anti-leishmanial stoffer, er også stærkt decimeret. Vedvarende indsats er nødvendig for at berige en ny anti-leishmanial lægemiddelforskning pipeline, og denne bestræbelse er afhængig af tilgængeligheden af egnede de vitro screening modeller.
<p class = "jove_content"> In vitro promastigoter 4 og axeniske amastigotes assays 5 anvendes primært til anti-leishmanial lægemiddelscreening kan dog ikke være hensigtsmæssigt som følge af betydelige cellulære, fysiologiske, biokemiske og molekylære forskelle i forhold til intracellulære amastigotes. Assays med makrofag-amastigoter modeller anses tættest på de patofysiologiske betingelser for leishmaniasis, og er derfor bedst egnet til in vitro-screening. Differentierede, ikke-delende humane akutte monocytiske leukæmiceller (THP1) (gøre en attraktiv) alternativ til isolerede primære makrofager og kan anvendes til at analysere anti-leishmanial aktivitet af forskellige forbindelser over for intracellulære amastigoter.Her præsenterer vi en parasit-rednings-og transformationsassay med differentierede THP1 celler inficeret in vitro med Leishmania donovani til screening rene forbindelser og naturlig proddukter ekstrakter og bestemme effekt mod de intracellulære Leishmania amastigotes. Assayet omfatter følgende trin: (1) differentiering af THP1-celler til ikke-delende makrofager, (2) infektion af makrofager med L. donovani metacyclic promastigoter, (3) behandling af inficerede celler med testlægemidlerne, (4) kontrolleret lysis af inficerede makrofager, (5) frigivelse / redning af amastigoter og (6) transformation af levende amastigoter til promastigoter. Assayet blev optimeret ved hjælp af detergent-behandling til kontrolleret lysis af Leishmania-inficerede THP1-celler for at opnå næsten fuldstændig redde levedygtige intracellulære amastigoter med minimal virkning på deres evne til at omdanne til promastigoter. Forskellige makrofag: promastigoter forhold blev testet for at opnå maksimal infektion. Kvantificering af infektionen blev udført ved transformation af levende, reddede Leishmania amastigoter til promastigoter og evaluering af deres vækst med en alamarBlue fluorometrisk assay i mikroplader med 96 brønde. Dette assay kan sammenlignes med den aktuelt anvendte mikroskopisk, transgene reportergen og digital-billedanalyse assays. Denne analyse er robust og måler kun de levende intracellulære amastigotes forhold til reportergen og billedanalyse assays, som måske ikke skelne mellem levende og døde amastigotes. Desuden er assayet blevet valideret med aktuel panel af anti-leishmanial lægemidler og er blevet anvendt til omfattende screening af rene forbindelser og et bibliotek af naturprodukter fraktioner (Tekwani et al. Upubliceret).
Der er flere metoder til rådighed for anti-leishmanial lægemiddelscreening baseret på makrofag-amastigote modeller. Assays kan udføres med makrofagerne indsamlet fra værtsdyr nemlig peritoneale eksudatceller (PEC), perifert blod monocyt-celler (PBMC) 6 eller knoglemarv-afledte makrofager (BMM) eller i monocytiske cellelinjer, såsom mus (J774 og RAW264.7 ) 7 og human (THP1, U937, HL-60) 8 monocytiske celler. Analyserne, der anvender dividere værtsceller, skal sikre, at forstyrrende virkninger af narkotika aktivitet på både parasit og vært celler nummer betragtes. De differentierede primære makrofager indsamlet fra forskellige kilder, såsom mus og rotter er ikke-delende i naturen, men disse cellepræparater måske ikke homogene cellepopulationer. Monocytiske celler-afledte cellelinier er homogene i natur og er en bedre model for makrofag-amastigote-baseret screening. Af forskellige monocytiske cellelinier, forskelrentiated THP1-celler (human akut monocytisk leukæmi cellelinje) kan danne en ikke-delende monolag og tilbyde et attraktivt alternativ til primære isolerede makrofager.
Den makrofag-amastigote-baseret screening kan gøres på flere måder. Klassisk mikroskopisk evaluering baseret på direkte celle og parasit tælle 9 er arbejdskrævende. Fraværet af automatisering begrænser anvendeligheden af dette assay. Tælling er tidskrævende og kan give unøjagtige bestemmelse af IC50-værdier, da bestemmelse af parasit levedygtighed gennem en farvningsprocedure er vanskelig. Mange fluorescerende farvestoffer og monoklonale antistoffer kan anvendes til flow-cytometriske assays 10, 11, men disse assays er også begrænset på grund af mindre følsomhed og begrænsning af tidsinterval af lægemiddel-behandling til kun én dag. Der er flere reportergenassays rådighed til at kvantificere væksten af intracellulære amastigoter 12,13,14. En automated screening kan være muligt ved hjælp af reportergener, men disse assays også visse ulemper. Dels fleste af disse assays kræver lægemiddelselektion til bevarelse episomal ekspression af reportergener, som ikke kan være ideelle til en lægemiddelscreening eksperiment. Den måde, hvorved reporter-gen indføres også kan påvirke de fysiologiske egenskaber af parasitten og påvirke screeningen. Hvis reportergenet er den del af et episomalt plasmid, kan den relative produktion af reporter afhænger af kopiantallet af det transficerede plasmid (som varierer fra celle til celle) end på aktiviteten af lægemidlet 14. Nogle reporter parasitter, der omdannes parasitter behøver ikke selektivt tryk for at bevare reportergenet, men kan der være biologiske konsekvenser enten ved at forstyrre den genomiske struktur eller blot ved tilstedeværelsen af de fremmede reporter-proteiner 15. I nogle reportergen-assays, er derspørgsmål om følsomhed og baggrund aktivitet 16. Vigtigst af alt kan mange af de reportergenekspression assays, specielt den ene med GFP reporter gene15, ikke skelne mellem de levende og døde intracellulære amastigotes. Assays baseret på luciferase-reportergen kan skelne mellem levende og døde intracellulære amastigoter, men substrat og cellelyse-puffer for disse assays er dyre til omfattende screening 17. For at overvinde disse skadevirkningen og begrænsninger af tidligere makrofag-amastigote-baserede screeningsassays, har vi udviklet og optimeret denne parasit-rednings-og transformationsassay. Dette assay er baseret på THP1-celler, som har en god homogenitet og er ikke-delende i naturen, som værtsceller.
Parasitten-Rescue-Transformation-Assay assay beskrevet her er sammenlignelig med assay baseret på digital-Image-Analyse-Direct-Optælling af de intracellulære amastigotes. Fluorescerende og DIC mikroskopi, digital image analyser ved ImageJ for differentieret optælling af makrofagen kerner og parasitten kerner har yderligere forfinet mikroskopisk tælling assay. Indfange billeder under fluorescerende lys filtre og differential interferens kontrast (DIC) filtre har forbedret kvaliteten af det digitale billede for mere nøjagtig optælling af de intracellulære parasitter. Både fluorescerende og DIC billeder kan flettes for at opnå de digitale billeder med klare makrofagcellelinier konturer og fluorescerende intracellulær kerner. Makrofagen kerner og parasitten kerner kan differentielt genkendes med ImageJ. Derfor er både digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-Assay har potentiale for automatisering og anvendelse i stor målestok screening. De kritiske trin i Parasite-Rescue-transformation-assay, er: (a) gentagne vaskninger af THP1 cellekulturer efter udsættelse for Leishmania promastigoter, for at sikre næsten fuldstændig fjernelse af ikke-praktikantenalized promastigoter og (b) kontrolleret lysis af inficerede THP1-celler med SDS. Begge trinnene kan også styres med automatisering og bør ikke på kompromis med gennemløb af assayet. Det andet trin af skyllevand efter eksponering af Leishmania-inficerede THP1-celler til testlægemidlerne / forbindelser fjerner de resterende ikke-internaliserede parasitter, hvis nogen. Parasitten-Rescue-Transformation-Assay byder på betydelige fordele i forhold til eksisterende mikroskopisk, reportergen og billedanalyse assays. Analysen er enkel, robust og reproducerbar, kan automatiseres for storstilet screening og derfor bør have vigtig anvendelse i screening af store forbindelser biblioteker til nye anti-leishmanial lægemiddelforskning. Endvidere kan assayet også anvendes til evaluering af infektiviteten af klinisk, samt, laboratorie-isolater af Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Den NCNPR-USDA-ARS Scientific aftale No 58-6408-2-0009, CDMRP tilskud Award # W81XWH-09-2-0093 af US Army Medical forskning og Materiel Kommando.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |