Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe
Summary
Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l'utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.
Abstract
L'architecture répétée et bien compris cellulaire du cervelet en font un système modèle idéal pour explorer la topographie du cerveau. Sous-tend son cytoarchitecture relativement uniforme est un ensemble complexe de domaines parasagittales de gène et l'expression des protéines. Le cloisonnement moléculaire du cervelet est reflétée par l'organisation anatomique et fonctionnelle des fibres afférentes. Pour apprécier pleinement la complexité de l'organisation du cervelet que nous avons déjà une approche affinée coloration wholemount pour l'analyse à haut débit de défauts de structuration dans le cervelet de souris. Ce protocole décrit en détail les réactifs, des outils, et des mesures pratiques qui sont utiles pour réussir à révéler des modèles d'expression de protéines dans le cervelet de souris adulte en utilisant immunomarquage wholemount. Les étapes mis en évidence ici démontrer l'utilité de cette méthode en utilisant l'expression de zebrinII / aldolaseC comme un exemple de la façon dont la topographie fine de la cerveau peut être révélé dans sonnatif conformation tridimensionnelle. Sont également décrits des adaptations apportées au protocole qui permet la visualisation de l'expression des protéines dans les projections afférentes et cervelets grande pour des études comparatives de la topographie moléculaire. Pour illustrer ces applications, les données de coloration afférente du cervelet de rat sont inclus.
Protocol
Discussion
Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour la coloration wholemount succès en utilisant une approche polyvalente immunohistochimique pour l'expression des protéines dans le cerveau révélateur en développement et les adultes. En utilisant cette approche, des motifs complexes moléculaires d'expression peut être analysée et la topographie du cerveau apprécié sans la nécessité de laborieuses et consommatrices de temps les procédures de sectionnement des tissus.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RVS est pris en charge par l'enquêteur nouvelle fonds de démarrage d'Albert Einstein College of Medicine de l'Université Yeshiva.
Materials
| Materials | Function in protocol |
| Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) | Allows for consistent and slow perfusion. |
| Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) | General use in perfusion and dissection. |
| Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) | To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle. |
| Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) | For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection. |
| Nutator (Fisher Scientific) | Used to keep tissue in motion during incubation periods. |
| 1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) | All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. |
| Perforated spoon (FST/10370-17) | Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution. |
| Leica MZ16 FA microscope | Used to examine wholemount staining. |
| Leica DFC3000 FX camera | Used to capture wholemount images. |
Table 1.
| Example calendar for a typical wholemount experiment | ||||||||
| Day 1 | Dent’s fix, room temperature, 8 hrs | Dent’s bleach, 4°C, overnight | ||||||
| Day 2 | 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each | 100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min |
100% MeOH, -80°C, overnight | |||||
| Day 3 | 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min | 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min | 100% PBS, room temperature, 60-90 min | 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min | 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each | PMT, 4°C, overnight | ||
| Day 4-5 | PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs | |||||||
| Day 6 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex) | ||||||
| Day 7 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PBT, room temperature, 2 hrs | Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized | |||||
Table 2.
| Recipes (*=prepare fresh every time) | |
| PBS (phosphate buffered saline) | 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417) |
| PFA (Paraformaldehyde) | Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353) |
| Dent’s Fixative3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
| Dent’s Bleach3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide |
| Enzymatic Digestion | 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. |
| PBST | PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.) |
| PMT25* | PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| PBT25* | PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| DAB* | Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction). |
| ABC Complex Solution | Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000) |
Table 3.
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