Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón
Summary
Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.
Abstract
Dentro del intestino residen poblaciones únicas de las células inmunitarias innatas y adaptativas que están involucrados en la promoción de la tolerancia hacia la flora comensal y antígenos alimentarios, mientras que concomitantemente a punto restante para montar las respuestas inflamatorias hacia el 1,2 patógenos invasores. Células presentadoras de antígeno, en particular los PED y los macrófagos, juegan un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmune intestinal a través de su capacidad de detectar y responder apropiadamente a la microbiota 3-14. El aislamiento eficiente de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales es un paso fundamental en la caracterización del fenotipo y la función de estas células. Mientras que muchos métodos eficaces de aislar intestinales células inmunes, incluyendo los DC y macrófagos, han sido descritos 6,10,15-24, muchas veces se basan en digestiones largas que pueden influir negativamente superficie celular expresión del antígeno, la viabilidad celular, y / o el rendimiento de la célula. Aquí, detalles de una metodología para el aislamiento rápido de un gran número de viable, los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Caracterización fenotípica de los DC intestinales y macrófagos se lleva a cabo por tinción aislados directamente con las células intestinales específicas fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales para el análisis de flujo de múltiples colores citometría. Por otra parte, CC de alta pureza y de las poblaciones de macrófagos están aislados de los estudios funcionales utilizando CD11c y CD11b magnética activadas por cuentas de células de clasificación seguido por la selección de células.
Protocol
Discussion
Figura 3. Factores importantes para la optimización del rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie. Rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie son afectados directamente por la duración de la digestión del tejido, las características específicas de la colagenasa, el grado de tejido picado, y la presencia o ausencia de inflamación, que puede afectar a la integridad del tejido y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Aaron Rae (Universidad de Emory, Departamento de Pediatría y Salud Infantil de núcleo de flujo de Atlanta) para la clasificación de células. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AA01787001, el Premio de Desarrollo de Carrera de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America, y una investigación de Emory-Egleston Children Center de semillas de subvención para TLD
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
| DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
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