Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши
Summary
Здесь мы подробно методику для быстрого выделения мышью кишечного дендритные клетки (ДК) и макрофаги. Фенотипические характеристики кишечной домена и макрофагов осуществляется с помощью многоцветной проточной цитометрии в то время как магнитный шарик обогащения следует сортировки клеток используют для получения особо чистых популяций для функциональных исследований.
Abstract
В кишечнике находятся уникальные популяции врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые участвуют в деле поощрения терпимости по отношению к комменсальных флоры и пищевых антигенов в то время как остальные готовы одновременно подключить к воспалительной реакции инвазивных 1,2 патогенов. Антиген представляющих клеток, в частности, домена и макрофагами, играют важную роль в поддержании кишечного иммунного гомеостаза через их способность чувствовать и адекватно реагировать на микробиоты 3-14. Эффективная изоляция кишечного домена и макрофагов является важным шагом в характеризующие фенотип и функцию этих клеток. Хотя многие эффективные методы выделения кишечной клетки иммунной системы, включая контроллеры домена и макрофагов, были описаны 6,10,15-24, многие полагаются на длительное время пищеварения, которые могут отрицательно влиять на клеточной поверхности антиген выражения, жизнеспособность клеток и / или выход ячейки. Здесь мы подробно методику для быстрого выделения больших количеств viablе, кишечные ДК и макрофагов. Фенотипические характеристики кишечной ДК и макрофаги осуществляют непосредственно окрашивание изолированных клеток кишечника с конкретными флуоресценции-меченных моноклональных антител для многоцветной проточной цитометрии. Кроме того, очень чистый DC и макрофагов населения изолированных функциональных исследований с использованием CD11c и CD11b магнитных активированной сортировки клеток бисером следует сортировки клеток.
Protocol
Discussion
Рисунок 3. Факторы, важные для оптимизации выхода клеток и экспрессия поверхностных антигенов. Выход клеток и экспрессия поверхностных антигенов напрямую зависят от продолжительности ткани пищеварения, специфику коллагеназы, степен?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Аарон Рей (Университет Эмори кафедры педиатрии и здравоохранения Детский основной поток Атланта) для сортировки клеток. Эта работа была поддержана грантом AA01787001 NIH, премии по развитию карьеры от Крона и колит фонда Америки, и Эмори-Egleston детского исследовательского центра семян грант TLD
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
| DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
Referências
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
- Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1–expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
