마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화
Summary
여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.
Abstract
소장 내에서 concomitantly 남아 침입 병원균의 1,2으로 염증 반응을 마운트 태세를하면서 공생 식물 및 식품 항원으로 허용 오차를 추진에 관여하고 타고난 및 적응 면역 세포의 독특한 인구 거주. 항원 제시 세포, 특히 DCS 및 macrophages은 감각 능력을 통해 장내 면역 항상성을 유지하는 중요한 역할을 적절하게 microbiota 3-14에 대응. 창자 DCS 및 macrophages의 효율적인 분리는 이러한 세포의 표현형 및 기능을 특성화의 중요한 단계입니다. DCS 및 macrophages를 포함한 장내 면역 세포를, 분리 많은 효과적인 방법은 6,10,15-24 설명되어 있지만, 많은 사람들이 부정적인 세포 표면 항원 발현, 세포 생존 및 / 또는 세포 수율에 영향을 미칠 수있다 긴 digestions 시간에 의존. viabl 다수의 신속한 격리를위한 여기서는 세부 방법론을E, 창자 DCS 및 macrophages. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성화 직접 멀티 컬러 흐름 cytometric 분석을위한 구체적인 형광 라벨이 표시된 단클론 항체와 격리된 창자 세포를 더럽히는 것에 의해 수행됩니다. 또한, 매우 순수 DC 및 대식 세포의 인구는 셀 정렬 뒤에 CD11c 및 CD11b 자기가 활성화된 세포 분류 구슬을 이용한 기능성 연구에 대해 격리됩니다.
Protocol
1. 해부와 창자 상피 세포의 분리 시약 및 장비의 준비 : 실온에 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 프리 PBS (CMF PBS). 5% FBS (CMF HBSS / FBS)와 실온에 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 무료 HBSS. 37까지 따뜻한 궤도 흔드는 ° C. 참고 : 1.7-1.1 단계는 세포 사망의 범위를 ?…
Discussion
그림 3. 세포 수율 및 표면 항원 표현의 최적화에 중요한 요인. 세포 수율 및 표면 항원 표현이 직접적으로 조직 소화 기간의 영향을받는, collagenase의 구체적인 특성, 닦지 조직의 정도와 염증의 유무, 이는 조직 무결성 및 cellularity 영향을 미칠 수 있습니다. 불충 분한 조직 소화가 분석을위한 세포의 소수가 발생할 수도 있지만 장기 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 셀 정렬을 위해 아론 레이를 (에모리 대학 소아과학과와 애틀랜타 흐름 코어의 어린이 건강 관리) 감사합니다. 이 작품은 TLD에 NIH 교부금 AA01787001, Crohn의 및 미국의 대장염 재단의 경력 개발 수상 및 에모리 – Egleston 아동 연구 센터 종자 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
| DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
Referências
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IsolationCharacterizationDendritic CellsMacrophagesMouse IntestineInnate Immune CellsAdaptive Immune CellsToleranceCommensal FloraFood AntigensInflammatory ResponsesAntigen Presenting CellsDCsMacrophagesIntestinal Immune HomeostasisMicrobiotaIsolation MethodsDigestion TimesCell Surface Antigen ExpressionCell ViabilityCell YieldPhenotypic CharacterizationFluorescence-labeled Monoclonal AntibodiesFlow Cytometric AnalysisFunctional StudiesCD11cCD11b Magnetic-activated Cell Sorting Beads
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Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040, doi:10.3791/4040 (2012).