Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall'intestino mouse
Summary
Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.
Abstract
All'interno l'intestino risiedono popolazioni uniche di cellule immunitarie innate e adattiva che sono coinvolti nella promozione della tolleranza verso la flora commensale e gli antigeni alimentari, mentre in concomitanza rimanendo in bilico per montare le risposte infiammatorie verso invasive 1,2 patogeni. Cellule presentanti l'antigene, in particolare DCS e macrofagi, giocano un ruolo critico nel mantenimento della omeostasi immunitaria intestinale attraverso la loro capacità di percepire e rispondere adeguatamente al microbiota 3-14. Isolamento efficiente di DC intestinali e macrofagi è un passo fondamentale nel caratterizzare il fenotipo e la funzione di queste cellule. Mentre molti metodi efficaci per isolare cellule immunitarie intestinali, compresi DC e macrofagi, sono stati descritti 6,10,15-24, contare su lunghe molte volte digestioni che possono influenzare negativamente l'espressione sulla superficie cellulare antigene, la vitalità cellulare, e / o quantità di cellule. Qui, si dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido di un gran numero di viablelettronici, DCS intestinali e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica delle DC intestinali e macrofagi viene effettuata direttamente colorazione cellule intestinali isolate con specifici anticorpi monoclonali marcati a fluorescenza per multi-colore analisi citofluorimetrica. Inoltre, DC altamente puro e popolazioni macrofagi sono isolati per studi funzionali utilizzano CD11c e CD11b magnetico attivati perline di separazione delle cellule seguite da selezione cellulare.
Protocol
Discussion
Figura 3. Fattori importanti per l'ottimizzazione della resa delle cellule e l'espressione dell'antigene di superficie. Resa cellulare e l'espressione dell'antigene di superficie sono direttamente interessati dalla durata della digestione dei tessuti, le caratteristiche specifiche del collagenasi, il grado di macinazione dei tessuti e la presenza o l'assenza di infiammazione, che possano pregiudicare l'integ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Aaron Rae (Emory University Dipartimento di Pediatria e Healthcare bambini di Core flusso Atlanta) per l'ordinamento delle cellule. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AA01787001, un Career Development Award dal morbo di Crohn e Colite Foundation of America, e della ricerca uno Emory-Egleston Children Center di sementi sovvenzione TLD
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
| DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
Referências
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
- Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1–expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
