Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm
Summary
Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.
Abstract
Binnen de darm verblijven, unieke populaties van aangeboren en adaptieve immuuncellen die betrokken zijn bij het bevorderen van tolerantie ten opzichte van commensale flora en voedsel antigenen, terwijl gelijktijdig de resterende klaar om ontstekingsreacties te monteren in de richting van invasieve pathogenen 1,2. Antigeen presenterende cellen, in het bijzonder DCs en macrofagen, spelen een cruciale rol bij het handhaven van intestinale immuun homeostase via hun vermogen om betekenis en adequaat te reageren op de microbiota 3-14. Efficiënte isolatie van intestinale DCs en macrofagen is een cruciale stap in het karakteriseren van het fenotype en functie van deze cellen. Hoewel veel effectieve methoden voor het isoleren intestinale immuuncellen, zoals DCs en macrofagen, zijn beschreven 6,10,15-24 veel vertrouwen op lange digesties maal negatief kan beïnvloeden cel oppervlakte antigen expressie levensvatbaarheid van de cellen en / of cel opbrengst. Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van grote aantallen viable-, darm-DCs en macrofagen. Fenotypische karakterisatie van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd door het rechtstreeks kleuring geïsoleerde darmcellen met fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen voor meerkleuren flowcytometrie. Bovendien zijn zeer zuiver DC populaties en macrofaag geïsoleerd functionele onderzoeken waarin CD11c en CD11b magnetische geactiveerde celsortering kralen gevolgd door celsortering.
Protocol
Discussion
Figuur 3. Factoren die belangrijk zijn voor het optimaliseren van cel-opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie. Cell opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie worden rechtstreeks beïnvloed door de duur van weefsel de spijsvertering, de specifieke kenmerken van de collagenase, de mate van weefsel hakken, en de aanwezigheid of afwezigheid van ontsteking, die van invloed kunnen weefsel integriteit en cellulariteit. Langdurige weefse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Aaron Rae (Emory University Department of Pediatrics en de Children's Healthcare van Atlanta Flow Core) voor celsortering. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie AA01787001, een Career Development Award van de Crohn en Colitis Foundation of America, en een Emory-Egleston Children's Research Center zaad subsidie TLD
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
| DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
Referências
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
- Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1–expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
