Summary

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Published: August 08, 2012
doi:

Summary

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。

Abstract

好中球は白血球の中で最も豊富なタイプです。彼らは、自然免疫系1の本質的な部分を形成しています。急性炎症時に、好中球は、損傷部位に移行する最初の炎症性細胞である。第二に、微小血管の構造変化と血漿タンパク質のエスケープを血流から;損傷部位への好中球の動員は、血流を増加させる血管の最初に、拡張を含む段階的なプロセスである全体の好中球の第三の、ローリング、接着と輪廻内皮細胞、傷害2,3のサイトでは好中球と4番目の蓄積。 in vivoおよび in vitro 方法の広い配列は、これらのプロセスの4の研究を可能にするために進化してきました。このメソッドは、ヒト内皮細胞間の好中球の移住に焦点を当てています。

好中球遊出に関与する分子プロセスを調べるための一つの一般的な方法は、人間のnを利用する初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)5との相互作用eutrophils。好中球の分離は、他の場所で視覚的に6に記載されています、従ってこの記事では、HUVECの単離のための方法が表示されます。一度分離し、コンフルエンスまで増殖、内皮細胞接着と活性化分子のアップレギュレーションで得られた活性化されています。例えば、増加したE-セレクチンとIL-8発現7のTNF-αの結果のようなサイトカインと血管内皮細胞の活性化。 E-セレクチン媒介する好中球およびIL-8を媒介する活性化と好中球の強固な接着のキャプチャとローリング。接着好中球は転生した後。輪廻はparacellularly起こる(血管内皮細胞の接合部を介して)またはtranscellularly(内皮細胞自体を介して)することができます。ほとんどの場合、これらの相互作用は、血管系7,8に見られるフローの状況下で発生します。

平行平板流室は広く使用されているシステムであり、そのマイルマイク流体力学的せん断は、 生体内に存在、in vitroで 9,10 フロー条件の下で好中球動員の研究を可能に強調しています。いくつかの企業は、平行平板フローチャンバーを生成し、それぞれに長所と短所があります。蛍光イメージングが必要な場合は、ガラスや光学的に類似したポリマーは、使用する必要があります。内皮細胞は、ガラス上でうまく育たない。

ここでは、位相コントラスト用に匹敵する光学特性をヒト内皮細胞の急速な付着と成長をサポートしているポリマーで作られた低容量ibidiチャネルスライドを用いて好中球遊出のDICと蛍光イメージングを簡単かつ迅速な方法を提示するガラス。この方法では、内皮細胞を増殖させたとibidiのμslideで刺激した。好中球は、フロー条件下で導入され、輪廻を評価した。接合部の蛍光イメージングは​​、対傍細胞の範囲のリアルタイム測定を可能にし経輪廻。

Protocol

1。ヒト血管内皮細胞の単離とメンテナンスヒトの血液や組織で作業する場合、レベル2バイオセーフティ手順を使用する必要があります。はさみを使用すると、胎盤から臍帯を切断し、密接に血栓と配信中にコードをクランプすることにより生じた損害についてコードを確認します。切り出し、コードのこれらの部分を破棄します。 50mgのコラゲナーゼを含むチューブに暖かい…

Discussion

研究者は定期的に好中球の動員と輪廻を研究するために別の血管床から内皮細胞を使用しています。例としては、皮膚微小血管内皮細胞12、肝類洞内皮細胞13とヒト臍帯静脈10から内皮細胞に限定されるものではない。中でもHUVECため絶縁性と可用性のそれらの相対的な使いやすさ、幅広い人気を博した。 HUVECは、 生体内で発生する多くの内皮細胞のプロセ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

彼女の技術支援のために氏Lailey;とヒト臍帯を提供するための、カルガリー、アルバータ州のフットヒルズ病院部51我々は博士ピナColarussoとイメージングと画像解析とその支援のためのライブセルイメージング施設に感謝します。健康ソリューションサイエンティスト:博士KDパテル氏はアルバータ州革新です。この作品は、イノベーションとアルバータ州科学·研究機関のカナダの財団からの健康研究機器やインフラの助成金のためのカナダの研究所からのオペレーティング·助成金によって支えられている。

Materials

Reagent and Equipment Company Catalogue number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197  
Cord buffer     Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM)     M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035  
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016  
Ibidi chambers Ibidi 80606  
TNF-α Prepro Tech 300-01A  
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050  
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X  
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X  

Referências

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
check_url/pt/4032?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

View Video