Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen
Summary
Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.
Abstract
Wie alle Negativ-Strang-RNA-Viren, wird das Genom von Influenzaviren in Form von viralen Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP), in dem die einzelsträngige Genoms durch das Nukleoprotein (NP) eingekapselt ist, und mit der Polymerase-Komplex aus trimeren verpackt der PA, PB1, PB2 und Untereinheiten. Allerdings, im Gegensatz zu den meisten RNA-Viren, Influenza-Viren führen virale RNA-Synthese in den Kernen der infizierten Zellen. Interessanterweise verwendet virale mRNA-Synthese zelluläre prä-mRNAs als Primer, und es wurde vorgeschlagen, dass dieser Prozess stattfindet Chromatin 1. Wechselwirkungen zwischen dem viralen Polymerase und der Wirts-RNA-Polymerase II, sowie zwischen NP und Host Nukleosomen wurden auch 1,2 ist.
Vor kurzem hat die Erzeugung von rekombinanten Influenza Viren, die für eine Ein-Strep-Tag genetisch mit dem C-Terminus des PB2-Untereinheit der viralen Polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) fusioniert hat seinen beschrieben. Diese rekombinanten Viren können die Reinigung von PB2-enthaltende Komplexe, einschließlich vRNPs, aus infizierten Zellen. Zur Gewinnung gereinigter vRNPs werden Zellkulturen infiziert und vRNPs sind affinitätsgereinigt aus Lysaten aus diesen Zellen abgeleitet. Allerdings haben die Lyse bisher angewandten auf einer Schritt-Detergens-Lyse, die, trotz der Gegenwart eines allgemeinen Nuklease, oft zu extrahieren Chromatin-gebundene Material nur ineffizient gestützt.
Unsere Vorarbeiten schlug vor, dass ein großer Teil der nuklearen nicht vRNPs wurden während der traditionellen Zell-Lyse extrahiert, und konnte deshalb nicht Affinität gereinigt werden. Um diese Extraktion Effizienz zu steigern, und zur Trennung von nicht-nuklearen Chromatin-gebundenen vRNPs Chromatin-gebunden, passten wir einen stufenweisen Extraktion subzelluläre Protokoll, um Influenza-Virus-infizierten Zellen. Kurz gesagt, dieses Verfahren zuerst trennt die Kerne aus der Zelle und extrahiert dann lösliche nukleäre Proteine (hier als die "nukleoplasmatischen"-Fraktion).Das verbleibende unlösliche nukleare Material wird dann mit Benzonase, ein unspezifischer DNA / RNA-Nuclease, die von zwei Salzgewinnung Schritte befolgt verdaut: zuerst mit 150 mM NaCl (genannt "CH150"), dann 500 mM NaCl ("CH500") (Abb. 1 ). Diese Salzgewinnung Schritte wurden auf der Grundlage unserer Beobachtung gewählt, dass 500 mM NaCl ausreichend, um über 85% der nuklearen vRNPs solubilisieren dennoch erlauben die Bindung von getaggt vRNPs an die Affinitätsmatrix war.
Nach subzelluläre Fraktionierung der infizierten Zellen, ist es möglich, Affinitätsreinigung PB2-markierten vRNPs von jedem einzelnen Fraktion und Analyse der Protein und RNA-Komponenten unter Verwendung von Western-Blot und Primer-Extension, jeweils. Vor kurzem verwendeten wir diese Methode, um diese vRNP Export Komplexe Form während des späten Punkte nach der Infektion auf der Chromatin-Fraktion mit 500 mM NaCl (CH500) 3 extrahiert entdecken.
Protocol
Discussion
Während viele Studien, die kürzlich einzelne Proteine oder Mobilfunknetze in Influenzavirus-Infektion beteiligt sind 8 identifiziert haben, bleibt die funktionelle Bedeutung der meisten dieser Interaktionen unklar. Angesichts der absoluten Abhängigkeit von Chromatin-basierten Funktionen für Influenza-Virus RNA-Synthese und die komplexe biophysikalische und biochemische Natur des Kerns 9, werden neue Techniken erforderlich, um diese Funktionen aufzuklären. Die Fraktionierung subnuklearen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Nada Naffakh und Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) für die rWSN-PB2-Strep Virus danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Referências
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