Количественный анализ Фитнес (КФД) является дополнительной серии экспериментальных и расчетных методов для оценки приспособленности микробной культуры. КФД оценивает влияние генетических мутаций, наркотиков или других прикладных процедур на микроб роста. Эксперименты масштабирование от целенаправленного анализа одной культуры до тысячи параллельных культур могут быть разработаны.
Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.
КФД является во многих отношениях прямой потомок трех установленных скамейке масштабе микробиологические методы: культура разведения серии тестов месте 9, кривая роста определения в газированных жидких культурах 9 и реплики покрытия 13. Эти три метода кратко и по сравнению с КФД и других высокопроизводительных методов в таблице 2. В то время как разведение тесты серии месте определить пригодность штамма, как его способность к образованию колоний в ряде культур, выращенных из ряда разведений посевной, КФД меры деформации фитнес на повторных наблюдений одного культуры для построения кривой роста. Количественная фитнес от одной культуры позволяет многие другие штаммы должны быть рассмотрены одновременно, в одинаковых условиях. Репликация массивов культур позволяет повторное тестирование штамма коллекций, наиболее полезным при тестировании культуры фитнес различия в различных средах или генетического происхождения. КФД протокол представленЗдесь используются дорогие роботы оборудования для репликации, прививать, инкубировать и плиты изображение агар, подходит для наблюдения роста тысяч независимых культур (робот КФД, таблица 2). Однако, поскольку КФД основана на установленных, традиционные методы лабораторию, он также может быть проведена гораздо дешевле заменить роботом с помощью ручных операций (ручной КФД, таблица 2). Руководство включает в себя КФД репликации и прививки культур на агар пластины с использованием ручного инструмента контактный и ручной передачи пластин и из инкубатора для фотографии. То же самое вычислительных рабочих анализа могут быть применены для создания кривых роста либо из эксперимента.
КФД фитнес оценки кажутся сравнительно точно. На рисунке 4, средние приспособленности четырех например кластеров функционально связанных удаления гена выделены. Непосредственной близости от членов каждого класса функционально связанных генов в двух независимыхЛОР-генетического фона (ura3Δ и cdc13-1) указывает на воспроизводимость КФД оценки пригодности. Например, только 3 гена удаления (из возможных 4300) отделяют три члена сохраняющийся комплекс MRX.
Высокая пропускная способность альтернативы КФД для проверки характеристик роста штаммов микроорганизмов включают SGA 5,6, конкуренция экраны в штрих библиотеки 11,12 и экранов захвата оптического кинетики плотности в спектрофотометрических читатели пластины 10, которые приведены в таблице 2 и более подробно описаны в другом месте 8 . КФД и SGA плит, где культуры растут на твердых поверхностях агара (агар на основе методов, таблица 2) могут быть обработаны быстро и легко робота. Твердые поверхности агара культур, хорошо газированной протяжении роста и клетки могут расти в основной культуры, что позволяет общительный микробов расти в обществе 14. Остаются нетронутыми, микробных сообществffect свой микро-среды, выделяя токсины, такие как этанол, и, возможно, сигналов между клетками. Тем не менее, непрерывного перемешивания жидких культур, необходимых для достижения адекватной аэрации, искусственно разрушает микробные сообщества и микро-среды, которые могут повлиять на их режимы роста. Кросс-загрязнение меньше беспокойства в твердом методы агар, поскольку существует меньше возможностей для проведения брызг жидкости клеток между культурами. Если заражение происходит в результате иностранной воздушно-капельным путем микробов в твердых анализов агар, его часто можно обнаружить при визуальном осмотре твердых пластин агара и приходится или удалены.
КФД пропускная способность значительно выше, чем у параллельного жидкости методами в двух направлениях. Прежде всего, по КФД (и SGA) пластин, привитых культур упакованы вместе более плотно, давая более независимой культуры в тарелку. В КФД там, как правило, 308 культур, не считая неэкспериментальных край культур (рис. 1) комсравнению с параллельным жидких культур с 96 или 100 культур в тарелку. Во-вторых, КФД эксперименты могут быть соизмеримы с гораздо большим количеством пластин. В то время как количество пластин проанализированы в одном эксперименте КФД ограничивается только места в инкубаторе или теплой комнате, минимально допустимая частота захвата изображения и максимально достижимая частота захвата, количество пластин в жидкости эксперимент рост сильно ограниченным по возможности ридер (как правило, одну или две тарелки), или укладчик прикреплены к ридер (обычно 25-50 пластин). Недавно мы провели полностью автоматизирован КФД эксперимент на 123 пластин, каждая с 308 экспериментальных культурах, давая 37884 одновременных культур. Мы считаем, что максимально достижимое количество независимых культур, растущих в жидкость 96 (культур / пластина) х 50 (плиты / укладчик) = 4800, что составляет примерно в десять раз меньше, чем наши КФД пропускной способности. Альтернатива для жидкости экранами культуры является использование многих автоматизированных Грут-го устройства параллельно (табл. 1 из обзора Blomberg 8), каждая из которых имеет емкость одной или двумя пластинами. Регулирование температуры в каждом устройстве не зависит, и поэтому условия не являются идентичными, но при условии, что они есть, это рабочий процесс потребует не менее 190 таких устройств в соответствии с КФД пропускная способность (при условии 200 жидких культур на устройство).
Таким образом, КФД является высококачественным рабочим процессом, который может быть с пользой применены для сбора количественных фенотипов роста в малых масштабах сосредоточены экспериментов и высокую пропускную способность экранов. Он достаточно гибок, чтобы эффективно применяться с различными требованиями к роботизированным оборудованием. Вычислительных компонент рабочего процесса КФД основана на свободном доступе, с открытым исходным кодом.
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем глубокую признательность всем членам нашей лаборатории и Центра по разработке системы биологии старения и питания (CISBAN) за поддержку и полезные обсуждения. Это исследование было поддержано биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (СИББН) (BB/C008200/1) и Wellcome Trust (075294, 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.