Chargement rétrograde des nerfs, des tracts, et les racines spinales avec des colorants fluorescents
Summary
Nous décrivons une technique simple et peu coûteuse pour l'introduction de la concentration élevée de colorants fluorescents et sensible au calcium dans les neurones ou de tout appareil neuronal aide d'une pipette d'aspiration en polyéthylène.
Abstract
Marquage rétrograde de neurones est une méthode standard de 1,2 anatomique qui a également été utilisé pour charger de calcium et de la tension des colorants sensibles dans les neurones 3-6. En général, les colorants sont appliqués sous forme de cristaux solides ou par injection sous pression locale en utilisant des pipettes en verre. Toutefois, cela peut entraîner une dilution de l'intensité de marquage colorant et réduite, en particulier lorsque plusieurs heures sont nécessaires pour la diffusion de colorant. Ici, nous démontrons une technique simple et à faible coût pour l'introduction de colorants fluorescents et sensible aux ions dans les neurones à l'aide d'une pipette d'aspiration en polyéthylène rempli de la solution de colorant. Cette méthode offre un moyen fiable pour le maintien d'une forte concentration du colorant en contact avec les axones à travers la procédure de chargement.
Protocol
Dextranes fluorescents ont été utilisés comme outils pour l'imagerie anatomique et l'activité neuronale 1-4. Fields et al. (2009) 4 a publié un protocole pour l'application d'ions et de tension des colorants sensibles à de vastes axonales avec un accent sur la moelle épinière comme un système modèle. Nous décrivons ici une procédure plus détaillée pour l'application de colorant fluorescent et / ou sensible aux ions de couper les racines et ventrales,…
Discussion
<p class="jove_content"> Nous décrivons ici un protocole simple et rentable pour l'introduction de colorants dans les neurones, les nerfs et les secteurs de la colonne vertébrale. Cette méthode consiste à exposer les voies anatomiques identifiés à une solution fortement concentrée de colorant pour la durée du processus de chargement. Il en résulte marquage rétrograde du site cible avec peu de fond par rapport à microinjections, l'application de bain et des techniques d'électroporation. Cependant, la méthode est limit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Ce travail a été soutenu par le programme intra-muros de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies à la National Institutes of Health. Nous tenons également à remercier le Dr George Mentis pour ses contributions antérieures à la méthode et les données de la figure 3.</p>
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
Referências
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Citar este artigo
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).