Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes
Summary
Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.
Abstract
Marcação retrógrada de neurónios é um método padrão 1,2 anatómica que também tem sido utilizado para carregar o cálcio e sensíveis à voltagem corantes em neurónios 3-6. Geralmente, os corantes são aplicados na forma de cristais sólidos ou por injecção sob pressão local usando pipetas de vidro. No entanto, isto pode resultar na diluição da intensidade de rotulagem de corante e reduzida, particularmente quando são necessárias várias horas para a difusão do corante. Aqui demonstramos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de corantes fluorescentes e de iões de sensível em neurónios utilizando uma pipeta de sucção de polietileno cheio com a solução de corante. Este método oferece uma maneira fiável para a manutenção de uma elevada concentração do corante em contacto com axónios em todo o procedimento de carga.
Protocol
Dextranos fluorescentes têm sido utilizados como ferramentas de anatómicos e para geração de imagens actividade neuronal 1-4. Campos et al, (2009) 4 publicou um protocolo para aplicação de íons e sensíveis à tensão corantes tratos axonais com um foco sobre a medula espinhal como um sistema modelo. Descrevemos aqui um procedimento mais detalhado para a aplicação de corante fluorescente e / ou iões de sensível para as raízes de corte ventral, raízes dorsais ou qualquer tracto…
Discussion
<p class="jove_content"> Descrevemos aqui um protocolo simples e de baixo custo para a introdução de corantes em neurônios, nervos e tratos espinhais. Este método envolve a exposição identificados vias anatómicas a uma solução altamente concentrada de corante para a duração do processo de carregamento. Isso resulta em marcação retrógrada do site de destino com fundo pouco em comparação com microinjeções, aplicação de banho e técnicas de eletroporação. No entanto, o método é limitado aos locais no sistema nervoso, ond…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Este trabalho foi financiado pelo programa intramural do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame no National Institutes of Health. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. George Mentis por suas contribuições anteriores para o método e os dados da Figura 3.</p>
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
Referências
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Citar este artigo
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).