Utilisation d'un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

1. Préparation de la plaque de cristallisation Mise en place de faire un essai de cristallisation robot commence par la préparation de la plaque de base de la plaque de cristallisation du verre sandwich (figure 2), décrit en détail dans la référence 2. La plaque de base doit d'abord être traité au silane et le bâton perforé double entretoise qui crée les puits, il faut appliquer à la plaque. Les matériaux et les fournitures nécessaires à cet effet sont détaillés sous la rubrique Matériel. Placez la plaque sur une serviette en papier, appliquer quelques gouttes de solution de silanisation et répartissez sur toute la surface de la plaque avec un mouchoir en papier. Retirer l'excès de solution de silanisation par immersion de la plaque dans un récipient rempli d'eau. Prenez la plaque de la bécher, placez-le sur une serviette en papier, côté silanisé en place, et sécher la surface exposée en frottant légèrement avec une serviette en papier. Retirez le couvercle de protection sur la perforation, double-bâton entretoiseet appliquer l'entretoise, côté adhésif vers le bas, à la surface sèche et silanisée de la plaque de verre. Assurez-vous que l'entretoise est positionné correctement sur la plaque de base, avec le coin supérieur gauche et les deux côtés adjacents de l'entretoise et la plaque, en même temps. Utiliser un rouleau ou rouleau-tampon pour aplatir l'entretoise sur la plaque de base et à créer un joint étanche entre eux. Plaques préfabriquées sont disponibles dans le commerce (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, dimensions moléculaires et LCP96T-UVP70U, Swissci). Pour des raisons de coût, on préfère monter nos propres plaques suivant le protocole ci-dessus. 2. En Méso Robot 1 Le premier robot à méso être démontré dans cet article la vidéo est celle actuellement en usage dans les États membres et FB Group (figure 3). Tous les détails du robot peut être trouvé sous Matériaux et dans l'article 5 de référence. Les matériaux et equipment nécessaire de mettre en place un essai de cristallisation en utilisant le robot sont détaillés sous la rubrique Matériel. Placer la plaque de base avec espacement préparés dans la section 1 sur le pont du robot. Il a sa propre plate-forme marquée avec des positions et à des fins de plaque de base d'alignement. La plaque doit être étiqueté aux fins d'identification. Fixer le bloc 96-précipitant ainsi dans sa propre plate-forme sur la plate-forme du robot à côté de la plaque de cristallisation. Ouvrez le bloc soigneusement en enlevant le bouchon d'étanchéité en plastique. Activer l'humidificateur et diriger le courant d'air humide et de l'autre côté sur la plaque de base sur le pont du robot. L'humidificateur a été montré pour réduire l'évaporation de la solution de précipitant et d'améliorer la reproductibilité de l'autre côté de la plaque 5 cristallisation. Il peut être mis en marche avant de mettre en place une pré-humidifier la zone où l'humidité relative ambiante est faible, ou non, juste avant la distribution de mésophase commence. Initialiser le robot en suivant les instructions du fabricant. Instructions spécifiques de l'instrument ne sera pas décrit ici en détail parce que les procédures exactes va changer au fil du temps. Pour l'essentiel, ce qui se produit pendant l'initialisation est que la distribution de mésophase bras du robot est muni d'positions de référence dans trois directions orthogonales X, Y et Z. Fixez la mésophase protéines chargées dans une seringue Hamilton, avec distribution d'aiguilles, à Bras 1 du robot (figure 3). Tous les détails de la façon de préparer la mésophase et comment le charger dans la seringue ont été décrits dans les références 3,7-10. Retirez le couvercle de protection supérieure de l'entretoise sur la cristallisation plaque de base et alignez les puits de la plaque avec des repères sur la plate-forme de base de la plaque. Remarque, dans le but de cette vidéo, le couvercle de protection a été laissé en place pour aider à la visionneuse lors de l'étape d'alignement. Alignez la pointe de l'aiguille de la distribution syringe avec le fond de la couche supérieure et dans le coin gauche de la plaque de cristallisation (puits A1). Ceci est réalisé en ajustant la hauteur des yeux ou de coordonnée Z du bras de distribution tout en regardant la proximité de la pointe de l'aiguille vient au fond du puits. Que la pointe est juste de toucher le fond du puits peut être jugée en déplaçant la plaque de gauche à droite sur la plate-forme tandis que très légèrement le réglage en hauteur du bras de distribution. Entrer dans l'ordinateur la coordonnée Z du bras de distribution lorsque les contacts d'extrémité de la plaque. Distribution est programmé pour avoir lieu avec la pointe de l'aiguille 80 micromètres à partir de cette référence Z-position qui correspond à la surface de la plaque de base. Position à l'œil nu la pointe de l'aiguille au centre du puits A1. A conserver dans l'ordinateur de contrôle de la référence X, coordonnée Y du bras de distribution lorsque la pointe est centrée. Cette coordonnée est utilisée pour définir le centre des puits restants sur la plaque. Prime la seringue en utilisant la commande appropriée sur l'ordinateur du robot afin de s'assurer que mésophase frais remplit l'aiguille de distribution et que les premiers puits et ensuite recevoir leur gamme complète de mésophase. Essuyez mésophase extrudé sur la pointe de l'aiguille avec un mouchoir. Démarrez le Robot Run (X-AP) programme d'initier un cycle de rinçage étapes où les conseils précipitants de distribution sur le bras 2 du robot sont lavés et sont prêts à aspirer des solutions à partir du bloc de précipitation. Activer l'. Dispenser fonction sur le robot pour mettre en mouvement le chargement séquentiel de puits avec des protéines chargé de mésophase (habituellement 50 nl) d'abord, une colonne de huit puits à la fois, suivie par des solutions précipitants (généralement 800 Nl) Entre les colonnes de chargement, les rendements mésophase bras distributeur à une position de stationnement où l'extrémité de l'aiguille est placée dans une éponge humide pour éviter la mésophase à la pointe de sécher. Le processus de distribution mésophase et précipitant est répété11 fois à travers la plaque jusqu'à ce que la plaque est remplie. Le chargement d'une plaque de 96 puits avec mésophase et précipitant prend 5 minutes à remplir. Dès que la plaque est remplie et les bras du robot sont retournés à leurs postes parc, retirez la plaque sur le pont du robot et placez-le sur une surface plane et solide. Immédiatement, sceller la plaque avec un couvercle en verre pour minimiser le temps dépendant de changements dans la composition bien. Il est important de veiller à ce que tous les puits 96 sont entièrement recouverts, que le couvre-objet est aligné avec le carré de plaque de base et que aucun des couvre-objet s'étend au-delà de l'empreinte de la plaque de base. Un galet ou rouleau-tampon est utilisé pour créer un joint étanche et un uniforme entre la lamelle et la pièce d'écartement. Inspecter la plaque pour s'assurer que la mise en place est allé comme il se doit. Ce que l'on cherche est un "oeuf sur le plat sur une plaque 'apparition dans chaque puits. Le jaune de l'oeuf sur le plat correspond à la mésophase. Le blanc de l'œuf est le précipitant solutiet sur le bord de la cuve est le périmètre de la cristallisation bien. Idéalement, les trois sont concentriques. Placer la plaque dans une zone de stockage à température contrôlée pour la croissance cristalline. Si aucun des plaques plus doivent être mis en place, retirez le bloc précipitant à partir du pont du robot, fermez-le complètement et de le remettre dans le stockage. Retirez la seringue contenant la mésophase du bras de distribution du robot, la démonter et laver ses parties, y compris l'aiguille de distribution et la virole, soigneusement avec du méthanol et sec en préparation pour la prochaine utilisation. 3. En Méso Robot 2. Mosquito LCP Le Mosquito LCP robot (figure 4) comprend un distributeur de mésophase similaire à celle utilisée par Robot 1. Contrairement à Robot 1, il distribue précipitant par l'intermédiaire d'embouts jetables. Logiciel de programmation est utilisé pour configurer l'instrument pour travailler avec des plaques de cristallisation particuliers et precipitblocs de fourmis, et pour distribuer des volumes définis par l'utilisateur de mésophase et de précipitation dans un ordre spécifié. Ces détails sont fournis par le fabricant et ne seront pas décrits ici. Préparer une seringue de Hamilton, avec son aiguille et rempli de protéines chargé de mésophase, comme décrit ci-dessus sous robot 1 et à l'article JoVE 1712 1. Serrer la seringue en position sur le bras de distribution du robot. Utilisez la plate-forme montée capteur laser pour établir les coordonnées X et Y de l'aiguille sur la seringue de distribution. Il s'agit d'une étape importante nécessaire pour s'assurer que la mésophase est distribué avec précision au centre de chaque puits de la plaque. Avec le toucher d'un bouton sur le panneau de commande, purger la seringue pour expulser mésophase de l'aiguille. Retirer mésophase extrudé à partir de la pointe de l'aiguille avec un mouchoir en vue de l'utilisation du robot pour charger puits. Avant de placer la plaque de cristallisation sur le pont de l'humidité de roboten la surface de la plate-forme avec quelques gouttes d'eau pour aider à maintenir la plaque en place par capillarité. Retirez le couvercle de protection de l'entretoise sur la plaque de base en verre et le placer sur sa plate-forme fermement pour assurer une bonne adhérence. Utiliser les trois repères sur la plate-forme pour aligner les 3 puits d'angle, assurant ainsi un positionnement correct des puits de la plaque par rapport à la pointe de l'aiguille de distribution. L'instrument est alors commandé pour entrer dans un cycle de distribution. Le cycle commence par une étape d'amorçage seconde où mésophase est distribué sur une petite plaque de verre juste avant de passer à charger puits avec mésophase frais. Les charges mésophase premier robot avec une colonne verticale de 8 puits sur la plaque, puis utilise les embouts jetables pour dispenser solution de précipitant au-dessus du bol mésophase. Le processus est répété 11 fois sur la longueur de la plaque jusqu'à ce que tous les puits sont remplis. L'ensemble du processus prend environ 5 minutes à compléter. Enleverla plaque remplie de la plate-forme du robot et de le sceller avec un couvercle en verre comme décrit ci-dessus en vertu de robot 1. Placer la plaque, bien marquée, dans un environnement à température contrôlée pour la croissance cristalline. 4. En Méso Robot 3. Gryphon LCP Le Gryphon LCP robot (figure 5) comprend un système de distribution mésophase similaire à celle décrite ci-dessus pour Robot 1 et 2. Ce qui la distingue des deux autres, c'est que les 96 solutions précipitants sont distribués simultanément. Préparer la mésophase protéines charge et chargez-le dans la seringue de distribution, tel que décrit ci-dessus, sous Robots 1 et 2, et à l'article JoVE 1712 1. Serrer la seringue en position sur le bras de distribution du robot. Placer le bloc de solution de précipitant et de la plaque de cristallisation sur le pont du robot. Chargez le hea 96-pointed avec des solutions de précipitation. Défini par l'utilisateur le temps de retard est prévu pour faciliter l'aspiration précipitants visqueux. Commander l'appareil pour saisir un cycle de distribution. Le cycle commence avec la mésophase être distribuée de manière séquentielle dans les 96 puits dans un processus qui prend environ 1 minute pour terminer. La tête 96-pointe distribue ensuite tous les 96 solutions précipitant à la fois au-dessus des bolus de mésophase dans les puits de cristallisation. Le processus plaque entière chargement est terminé en 2 min. Retirer la plaque remplie à partir de la plate-forme du robot et de le sceller avec un couvercle en verre, comme décrit ci-dessus sous 1 Robot. Placer la plaque, bien marquée, dans un environnement à température contrôlée pour la croissance cristalline. 5. Les résultats représentatifs Le but de cet article vidéo est de montrer comment mettre en place des essais de cristallisation automatiquement avec un liquide visqueux, protéine membranaire chargé de mésophase en verre Sandwicplaques de cristallisation h à 96 puits. L'accent est mis sur l'automatisation grâce à l'utilisation de robots spécialisés qui nécessitent un minimum d'intervention manuelle. Reproductibilité et la précision, en termes de volumes de mésophase et précipitant distribuée et la mise en place de l'intérieur du puits, on s'attend quand un robot est utilisé. Elles sont importantes du point de vue d'un dépistage efficace des conditions qui favorisent la cristallogenèse. Ils sont également essentiels pour la prochaine étape dans le pipeline d'analyse qui consiste à évaluer la croissance des cristaux se fait souvent avec l'équipement d'imagerie. Lieu de dépose ou de bolus est essentielle pour le processus d'imagerie, et le placement irrégulier et incorrect de bolus dans le puits nécessite habituellement intervention de l'utilisateur pour corriger et prend du temps. A titre d'illustration, des exemples de plaques correctement et incorrectement chargées sont présentés dans la figure 6. Figure 1. L'organigramme résume les étapes de la production, de récolte et de cryo-refroidissement à méso-cultivés cristaux de protéines membranaires. Étapes, entourée par la ligne pointillée rouge font l'objet de cet article JoVE. Les robots ont été utilisés pour distribuer des solutions mésophase et précipitant dans les étapes 29-32. De la référence 3. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. A pleine charge et scellé plaque de 96 puits de cristallisation du verre sandwich. Chaque puits contient 50 nl phase cubique et 1 ul de solution de précipitation. Pour plus de clarté, la phase cubique a été coloré avec le rouge Soudan et la solution de précipitant comprend le bleu de méthylène. De la référence 5. _upload/4000/4000fig3.jpg "alt =" Figure 3 "/> Figure 3. Dans méso robot (Robot 1). Le robot a deux bras. Bras 1 dispense le mésophase protéines chargé lipidique. Bras 2 distribue des solutions précipitants. Pendant le remplissage, la plaque 96-puits reste fixe en position sur la plate-forme du robot lui-même qui est à l'arrêt. Les deux bras se déplacent pour offrir des solutions mésophase et de précipitation. De la référence 3. Figure 4. Le Mosquito LCP robot (Robot 2). Contrairement à Robot 1, le pont de la LCP Mosquito, sur laquelle asseoir la plaque de 96 puits et le bloc de solution de précipitant, se déplace horizontalement pendant le remplissage. Figure 5. Le Gryphon LCP robot (Robot 3). Au cours d'unemis en place, le distributeur phase lipidique cubique se déplace pour fournir des protéines chargé de mésophase sur la plaque de 96 puits. La plate-forme se traduit ensuite horizontalement afin de positionner la plaque sous la tête de pointe solution de précipitant. Les 96 solutions précipitants sont distribués simultanément. Image provenant du fabricant ( http://www.artrobbins.com/ ) et étiquetés. Figure 6. A pleine charge et scellé de 96 puits en plaque sandwich verre (A) et les puits correctement (B) et mal (C, D) rempli en utilisant le méso en robot (Robot 1). L'étiquette code à barres sur la plaque A est utilisé pour suivre la plaque de la plaque incubateur / appareil d'imagerie. Dans les panneaux de BD, la solution de précipitant et de mésophase sont marquées P et M, respectivement. La attendu 'oeuf sur le plat sur une plaque'aspect du puits en B est caractéristique d'un correctement chargé et scellé bien. En C, la précipitation a été distribuée dans le puits de façon irrégulière en une position excentrée et est entré en contact avec l'entretoise. En C, il semblerait aussi que le volume de mésophase est inférieure à ce qu'elle devrait être. Un exemple de chargement incomplet avec une solution de précipitant est représenté sur la D. Pour l'échelle, le diamètre de tous les puits est de 6 mm.