Esaminando il ruolo della rinofaringeo associata Tissue linforeticolare (NALT) nelle risposte mouse ai vaccini

1. Raccolta NALT e Culturing Euthanize topo, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l'uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Trasferimento topi ad un asettico spazio di lavoro o di biosicurezza cabinet. Rimuovere la mascella inferiore del mouse e pulire la zona superiore palato con batuffoli imbevuti d'alcol e iodio. Utilizzare una lama chirurgica No. 11 nel manico del coltello per tagliare con cura chirurgica e delle accise il palato superiore, seguendo il contorno interno degli incisivi del mouse e dei denti molari. Staccare delicatamente il palato con le pinze, facendo attenzione a non strappare il palato. Questo passaggio è necessario per ridurre la contaminazione di culture ed è progettato per l'elaborazione palati più. Inserire palati in pozzetti individuali nella prima colonna di una sterile 48-pozzetti pre-riempito con 250 pl di mezzo di coltura completo (37 ° C) costituito da RPMI 1640 integrato con 10% siero fetale bovino, 100 pg / ml streptomicina, 100 UI / ml penicillina, 50 ug / ml di gentamicinae 1 pg / ml fungizone / amfotericina. I media dovrebbero essere tamponata con carbonato di palati se vengono coltivate in una CO 5% 2/95% di aria umida incubatore (37 ° C), o in alternativa utilizzare HEPES 10 mM pH 7,4, per i non-CO 2 cultura. Per lavare i palati, usare una pinza per spostare palati in ogni pozzetto successivo in una fila, con attenzione toccando la piastra tra un lavaggio e, fino a quando il palato ha subito un totale di otto lavaggi. Trasferire il palato in una nuova sterile 48-pozzetti contenente 250 pl di fresco, mezzo di coltura completo (37 ° C) in pozzetti. Collocare le piastre contenenti le palati in un incubatore a 37 ° C per coltura per tutta la durata dello studio. Raccogliere campioni per analisi asetticamente trasferendo 100 pl di mezzo da pozzetti di coltura in provette Eppendorf ogni 24 ore, sostituendo con 100 pl di 37 ° coltura fresco C terreno. Centrifugare i campioni coltura mezzi a 380 xg per 10 minuti, 4 ° C, a detriti pellet. Trasferire il supernatante dal campione centrifugato a nuove provette Eppendorf e conservare a -20 ° C fino al momento analizzare. Antigene-specifica IgG, IgM e IgA, o citochine secrete sono misurate in tessuto-coltura surnatanti mediante le normali metodica immunoenzimatica (ELISA). 2. Ablazione chirurgica delle NALT Femmina BALB / c topi, da 7 a 9 settimane di età, sono soggetti idonei, ma altri ceppi sono anche accettabili. Fornire gel-like cibo umido tre giorni prima della chirurgia per acclimatarsi sostituto del mouse per cibo e acqua, che sarà gestito post-operatorio. Somministrare una goccia di sollievo dal dolore Metacam farmaco (1,5 mg / ml o 0,05 mg / drop) nella cavità orale prima dell'intervento. Anestetizzare topi usando approvato guida IACUC, per esempio, con ketamina, acepromazina, e miscela xilazina (KAX) e applicare una pomata Puralube Vet su occhi per prevenire l'essiccazione. Evitare l'uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Anesthesia può essere confermata l'assenza di risposta riflessa ad un pizzicotto dolce delle dita dei piedi. Somministrare 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% di cloruro di sodio USP di iniezione) per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per prevenire la disidratazione potenzialità del mouse dopo l'intervento. Anche amministrare 0,1 mL di Respiram per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per promuovere la respirazione sana durante e dopo l'intervento chirurgico. Fornire supporto termico al mouse durante tutte le manipolazioni successive. Posizionate il mouse anestetizzato in posizione supina, e utilizzare due anelli separati di sutura chirurgica circa gli incisivi superiori e inferiori a sollevare delicatamente aperto la bocca, esponendo il palato superiore. Utilizzare un No. 11 lama chirurgica praticare un'incisione di circa 3 mm di lunghezza lungo la linea mediana del palato superiore nel sito del NALT. Inserire un microcurette 0,5 mm nel incisione e raschiare delicatamente sotto i bordi perinterrompere la NALT. Cauterizzare l'incisione per arrestare l'emorragia con un ciclo dritto bene su un gruppo termico cauterio. Continua supporto termico, mentre recupera il mouse verso la piena consapevolezza e l'attività. Fornire il mouse con soluzione salina per via sottocutanea fino a tre volte al giorno, 1 ml per iniezione tra le scapole, per prevenire la disidratazione, come farmaci per il dolore necessario, e per via orale una volta al giorno per 3 giorni post intervento chirurgico. Determinare la disidratazione eseguendo un test tenda di pelle per verificare turgore della pelle. Afferrare pelle e del pelo tra le lame spalle in modo che sia tented alto. Se la pelle ritorna rapidamente al normale, posizione precedente, il mouse non è disidratato. Se la pelle rimane elevata e si muove lentamente, il topo è in uno stato di disidratazione e richiede salina. Fornire cibo umido per almeno tre giorni dopo un intervento chirurgico per un tempo sufficiente per il recupero. Prima di tutte le procedure sperimentali, osservare i topi per 8-10 giorni, monitorando l'aumento di peso. Peso scarso recuperodi solito indica la guarigione incompleta palato, e questi topi dovrebbero essere ritirati dal ulteriori studi. 3. Preparazione NALT per l'istologia e valutare il successo di Chirurgia NALT Il successo della chirurgia NALT deve essere accertata da istologia come descritto di seguito. Dopo aver completato tutti gli studi sperimentali, preparare i topi per le collezioni cranici da eutanasia utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l'uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Afferrare la nuca del mouse eutanasia. Rimuovere la mandibola inferiore dal resto del cranio tagliandoli attraverso i processi condilari con forbici su entrambi i lati. A partire dalla nuca, togliere la pelle e la pelliccia dal cranio lentamente pelatura e taglio verso il lato ventrale del cranio. Rimuovere con cura la pelle intorno alla zona nasale e tagliare la pelle al largo della punta del muso per rimuovere completamente. Staccare il cranio dalla wit vertebresnip ha delle forbici. Inserire le forbici nel forame magno e tagliare a metà il cranio lungo la linea mediana per consentire la permeazione di formalina nei tessuti molli durante la fissazione. Fissare cranio in 10% formalina tamponata neutra (NBF) per 24 ore a temperatura ambiente. Per decalcificazione, posizionare il campione e la cassetta separata, avvolto in una garza per impedire Rexyn di toccare l'osso, in bottiglia con la miscela di acido formico. Incubare per 12 ore a temperatura ambiente, poi lavare continuamente sotto acqua di rubinetto per circa 20 minuti. Tagliare il campione al setto nasale e passate orbite l'occhio con una lama di rasoio. Campione e cassette possono essere conservati a breve termine nel 10% NBF. Porre campione su un processore tessuto per l'elaborazione notte. Questo viene fatto per rimuovere l'acqua dal campione in preparazione per paraffina. Rimuovere il tessuto trasformati, incorporare in un blocco di paraffina con il muso verso il basso, e lasciarlo raffreddare. Trim rough 15 um sezioni trasversali del blocco con un microtomo automatizzato, avvicinando la posizione approssimativa del NALT, poi continuare il taglio in sezioni 5 micron per il montaggio su vetrini in un bagno di acqua 44,3 ° C. Ematossilina ed eosina (H & E) colorazione istologia dovrebbero essere utilizzati per valutare l'ablazione NALT. 4. Raccolta di campioni biologici provenienti da topi 4,1 Siero Con attenzione elevando la temperatura corporea con una lampada di calore aumenta il flusso sanguigno. Prelevare il sangue per intaccare la vena laterale della coda con una lama chirurgica. Lasciare che il sangue gocciolare liberamente in un tubo separatore di siero Microtainer. Applicare una leggera pressione al nick con materiale assorbente, come la garza o un asciugamano, per fermare il flusso di sangue. Lasciare che il sangue coaguli nelle Microtainers per 30 minuti, quindi centrifugare tra 6-15 x 1000 g per almeno 90 secondi. Commutazione separato dal siero Microtainer in una provetta pulita per Eppendorfconservazione a -80 ° C. 4,2 Saliva Tenete il mouse anestetizzato verticale durante il pipettaggio 20-30 fosfato ul sterile soluzione salina tamponata (PBS) tra la guancia e la gengiva. Raccogliere la saliva diluita dirigendo punta della pipetta tra la guancia e la gengiva. Trasferire la saliva diluito in una nuova provetta contenente 10 L di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. 4.3 secrezioni nasali Eutanasia del mouse prima di raccogliere le secrezioni nasali, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l'uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Tenendo il mouse verticalmente, con attenzione pipettare 30 microlitri di PBS sterile in una narice e raccogliere risciacquo da altra narice. Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. 4.4 secrezioni vaginali Inserire la punta di una micropipetta nell'apertura di thvulva e del mouse eutanasia, lavare la vagina con 50 microlitri di PBS sterile e raccogliere tutto il liquido dalla micropipetta. Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. 5. Anticorpi antigene-specifici o citochine nei campioni raccolti possono essere misurate mediante ELISA o un altro metodo quantitativo. 6. Risultati rappresentativi La Figura 1 fornisce una vista schematica generale di fasi coinvolte con l'elaborazione del NALT contenente tessuto per l'analisi ex vivo. In Figura 2 (A, B), la dimensione del palato è mostrato, così come la posizione del incisione ablazione durante l'intervento chirurgico (A), come indicato dalla linea tratteggiata. La posizione di NALT sono indicati da frecce nella zona premolare su un asportato ematossilina-tinto palato in Figura 2 (C), mostra i tessuti paralleli. Figura 3presenta passaggi della chirurgia interruzione NALT, mostrando l'esposizione del palato superiore per l'accesso a NALT (A, B), ablazione (C), e la cauterizzazione finale della incisione (D). Un tipico EE sezione trasversale della zona del seno nasale circostante il NALT prima dell'intervento chirurgico è mostrato in Figura 3E, mentre un'immagine di perturbazione NALT dal microcurette direttamente dopo l'intervento appare in figura 3F. Un tempo sufficiente per il recupero da un intervento chirurgico, le incisioni devono essere chiusi e la cavità nasale privo di NALT (Figura 3G). Tipici risultati sperimentali ottenuti con queste tecniche sono mostrati nella Figura 4, confrontando supernatanti di coltura dei tessuti e campioni biologici da uno studio di un vaccino a subunità stafilococco (STEBVax). I topi sono stati somministrati STEBVax da intranasale (IN) o intraperitoneale (IP) rotte. Il vaccino è stato formulato con un adiuvante che attiva il recettore Toll-like 4 percorso di 3,1 4, e controlli sono stati dati solo soluzione salina o vaccino senza adiuvante. NALT Cultured ottenuti da gruppi sperimentali secreto antigene-specifiche immunoglobuline in mezzo che era misurabile con il metodo ELISA. In questo esempio (Figura 4A), i risultati indicano che le grandi quantità di IgA sono stati rilasciati dal NALT ottenuti da topi vaccinati con un vaccino a subunità combinato con adiuvante. I campioni biologici (come siero, saliva, secrezioni nasali, secrezioni vaginali) acquisiti dal controllo o NALT-topi senza può essere utilizzato per analizzare la risposta in vivo immunitaria agli antigeni nasali per confronto con i risultati delle colture tissutali. In figura 4b, IgA e IgG risposte nella vaccinazione erano significativamente ridotta senza NALT funzionale. I livelli di antigene-specifica IgA erano generalmente superiori IgG nelle secrezioni mucose (saliva, lavaggi nasali) dei topi vaccinati. upload/3960/3960fig1.jpg "/> Figura 1. Schema di raccolta NALT e la coltura ex vivo. Figura 2. Visualizzazione del palato topo che indica la posizione di incisione NALT e chirurgia. Dimensioni e posizione del palato superiore con incisione chirurgica indicata con linea tratteggiata (A); palato superiore escluso (B) o colorate in ematossilina (C) per visualizzare il NALT parallelo nella zona premolare del palato (tinto viola scuro sul lato anteriore del palato ). NALT indicato dalle frecce. Figura 3. NALT interruzione chirurgica. Le fasi principali della chirurgia interruzione NALT: vista supina del palato superiore del mouse prima dell'intervento chirurgico (A); incisione sulla linea mediana fatta palato superiore per accedere al NALT (B); microcurette sonda inserita attraverso un'incisione mediana per interrompere struttura in NALTgrità (C); cauterizzazione di incisione a conclusione dell'intervento (D). Immagini al microscopio delle cavità nasali, colorati H & E, prima della chirurgia (E), subito dopo l'intervento chirurgico (F), e un successo guarito, NALT-free di topo (G). Figura 4. Vaccino anticorpi specifici da NALT colta, saliva e secrezioni nasali raccolti dai topi vaccinati. Topi di controllo NALT-free o normale sono stati vaccinati o IP con STEBVax e campioni biologici sono stati raccolti. I livelli anticorpali dei campioni in triplicato sono stati misurati usando ELISA. (A) NALT sono stati rimossi dai topi di controllo (non chirurgicamente manipolata) e messe in coltura per esaminare la risposta anticorpale. Il vaccino-specifica risposta di IgA in coltura per IN topi vaccinati era statisticamente differente da controlli (Student t-test, p ≤ 0,01, rispetto al non adiuvante o no vaccino). (B) interruzione NALT sostanzialmente ridotto risposte anticorpali specifichea IN vaccinazione. Ci sono state differenze significative tra i livelli di anticorpi specifici di NALT-and NALT + gruppi (non intervento chirurgico o di controllo) per tutti i confronti, tranne saliva risultati IgG (Student t-test, p ≤ 0,05).