Überprüfung der Rolle der Nasopharynx-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) in Maus auf Impfstoffe

1. NALT Sammlung und Anzucht Einschläfern Mäusen unter Verwendung genehmigt IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Übertragen Mäusen zu einer aseptischen Arbeitsbereich oder Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie den Unterkiefer des Maus und reinigen Sie den oberen Gaumen mit Alkohol und Jod Tücher. Verwenden Sie eine chirurgische Klinge Nr. 11 in der chirurgischen Messergriff zu sorgfältig geschnitten und Verbrauchssteuern den oberen Gaumen, indem Sie die Innenkontur der Maus Schneidezähne und Backenzähne. Vorsichtig abziehen der Gaumen mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne zu reißen, um den Gaumen. Dieser Schritt ist notwendig, um eine Kontamination der Kulturen zu reduzieren und zum Verarbeiten mehrerer Gaumen gestalten. Platz Gaumen in einzelne Wells in der ersten Spalte einer sterilen 48-Well-Platte mit 250 ul vollständige Kulturmedium vorgefüllt (37 ° C), bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 100 ug / ml Streptomycin, 100 UI / ml Penicillin, 50 ug / ml Gentamicinund 1 pg / ml Fungizon / Amphotericin. Die Medien sollten basisch gepuffert, wenn Gaumen in einem 5% CO 2/95% feuchter Luft Inkubator (37 ° C), oder nutzen Sie alternativ 10 mM HEPES pH 7,4, für Nicht-CO 2-Kultur gezüchtet werden. Um den Gaumen zu waschen, verwenden Pinzette Gaumen in jedem aufeinanderfolgenden gut in einer Reihe zu bewegen, vorsichtig Ausklopfen zwischen Wäschen, bis der Gaumen mit insgesamt acht Wäschen unterzogen wurde. Übertragen Sie die Gaumen in eine neue sterile 48-Well-Platte mit 250 ml frisches, komplettem Kulturmedium (37 ° C) in Brunnen. Legen Sie die Platten mit den Gaumen in ein 37 ° C Inkubator zur Kultivierung für die Dauer der Studie. Entnehmen Sie die Proben für die Analyse durch die Übertragung aseptisch 100 ul Medium aus Kultur-Wells in Eppendorf-Röhrchen alle 24 Stunden, ersetzen mit 100 ul frischen 37 ° C Kulturmedium. Zentrifugation der Kulturmedien Proben bei 380 × g für 10 Minuten, 4 ° C, um Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand aus dem zentrifugierten Probe an die frische Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C bis zum Gebrauch zu analysieren. Antigen-spezifische IgG, IgM und IgA oder sezerniert Zytokine werden in Gewebekultur-Überständen durch Standard-Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) gemessen. 2. Chirurgische Ablation von NALT Weibliche BALB / c Mäuse, 7-9 Wochen alt sind, eignen sich Themen, aber auch andere Stämme sind ebenfalls akzeptabel. Geben gelartige Nassfutter 3 Tage vor der Operation, um Maus, um Nahrung und Wasser ersetzen, die nach der Operation verabreicht wird, akklimatisieren. Verwalten Sie einen Tropfen Metacam Schmerzmittel (1,5 mg / ml oder 0,05 mg / Drop) in die Mundhöhle vor der Operation. Anesthetize Mäusen unter Verwendung genehmigt IACUC Führung, zum Beispiel mit einer Ketamin, Acepromazin, und Xylazin Gemisch (KAX) und gelten Puralube Vet-Salbe auf die Augen ein Austrocknen zu verhindern. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Einnesthesia kann durch das Fehlen von Reflex auf einem sanften Einklemmen der Zehen bestätigt werden. Administrieren 1 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid-Injektion USP) subkutan zwischen die Schulterblätter mit einer 22-28 Gauge-Nadel und Spritze, um mögliche Austrocknung der Maus nach der Operation zu verhindern. Auch verabreichen 0,1 mL Respiram subkutan zwischen die Schulterblätter mit einer 22-28 Gauge-Nadel und Spritze an gesunde Atmung während und nach der Operation zu fördern. Stellen eine thermische Unterstützung für die Maus bei allen nachfolgenden Manipulationen. Setzen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage, und verwenden Sie zwei getrennte Schleifen von chirurgischen Naht um den oberen und unteren Schneidezähne zu hebeln den Mund öffnen, Freilegung der oberen Gaumen. Verwenden Sie einen Nr. 11 Skalpell, um einen Einschnitt von etwa 3 mm in der Länge entlang der Mittellinie des oberen Gaumen in der Stelle des NALT machen. Legen Sie eine 0,5 mm microcurette in den Einschnitt und vorsichtig unter die Kanten zu kratzenstören den NALT. Cauterize den Einschnitt, um eine Blutung mit einem geraden feinen Schleife auf einem Thermokauter Gerät zu stoppen. Weiter thermische Unterstützung während Maus wieder zu vollem Bewusstsein und Aktivität. Geben Maus mit Kochsalzlösung subkutan bis zu dreimal am Tag, 1 ml pro Injektion zwischen den Schulterblättern, zu Austrocknung und bei Bedarf orale Schmerzmittel verhindern einmal täglich für 3 Tage nach der Operation. Bestimmen Sie Austrocknung der Haut durch Ausführen eines Zelt-Test für Hautturgor überprüfen. Fassen Sie die Haut und das Fell zwischen den Schulterblättern Schaufeln, so dass diese Tented auf. Wenn die Haut schnell wieder in den normalen, vorherigen Position, ist die Maus nicht dehydriert. Wenn die Haut bleibt erhöht und bewegt sich langsam, ist die Maus in einem Zustand der Dehydrierung und erfordert Kochsalzlösung. Geben Sie Nassfutter für mindestens drei Tage nach der Operation, um genügend Zeit zur Erholung zu gestatten. Vor der Durchführung der experimentellen Verfahren, beobachten Mäuse für 8-10 Tage durch das Verfolgen Gewichtszunahme. Schlechte Gewicht Erholungnormalerweise darauf hin, unvollständige Gaumen Heilung, und diese Mäuse sollten von weiteren Studien zurückgezogen werden. 3. Vorbereiten NALT für Histologie und die Beurteilung des Erfolges NALT Chirurgie Der Erfolg der Operation NALT muss durch Histologie festgestellt, wie unten beschrieben. Nach Abschluss aller experimentellen Studien, bereiten Mäuse für die Schädel-Sammlung von euthanizing Verwendung genehmigt IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Fassen Sie den Nacken der Maus eingeschläfert. Entfernen Sie den Unterkiefer aus dem Rest des Schädels durch Schnippeln durch die Gelenkfortsätze mit einer Schere auf beiden Seiten. Beginnend am Nacken, entfernen Sie die Haut und das Fell aus dem Schädel durch langsames Schälen und Schneiden in Richtung der ventralen Seite des Schädels. Entfernen Sie vorsichtig Haut um den Nasenbereich und schnippeln die Haut von der Spitze der Schnauze vollständig zu entfernen. Nehmen Sie den Schädel aus den Wirbeln Witzha snip der Schere. Legen Schere in das Foramen magnum und schneiden auf halber Höhe des Schädels entlang der Mittellinie gegen die Permeation von Formalin in die Weichteile während der Fixierung ermöglichen. Fix Schädels in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für 24 Stunden bei Raumtemperatur. Um entkalken, legen Sie die Probe und separaten Kassette, eingehüllt in Gaze zu Rexyn vom Berühren des Knochens, in der Flasche mit der Ameisensäure Mischung zu verhindern. Inkubieren Sie für 12 Stunden bei Raumtemperatur, dann kontinuierlich unter fließendem Wasser spülen für ca. 20 Minuten. Schneiden Sie die Probe auf die Vergangenheit Septum und das Auge Umlaufbahnen mit einer Rasierklinge. Sample und Kassette kann für kurzfristige in 10% NBF gespeichert werden. Platzieren Sie Probe auf eine Gewebe-Prozessor für die Verarbeitung über Nacht. Dies geschieht, um Wasser aus der Probe zu entfernen, in Vorbereitung auf Paraffineinbettung. Entfernen Sie verarbeiteten Gewebe, in einem Paraffin-Block mit der Schnauze nach unten einbetten, und lassen Sie es abkühlen. Trim rough 15 um Querschnitte des Blocks mit einem automatisierten Mikrotoms, nähert sich die ungefähre Lage des NALT, dann weiter Schneiden in 5 um Abschnitte zur Montage auf Glas-Objektträger in einer 44,3 ° C warmes Wasserbad. Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung Histologie sollte verwendet werden, um NALT Ablation zu beurteilen. 4. Sammlung von biologischen Proben von Mäusen 4,1 Serum Vorsichtig heben die Körpertemperatur mit einer Wärmelampe erhöht den Blutfluss. Blutentnahme durch Nicking die laterale Schwanzvene mit einer chirurgischen Klinge. Lassen Sie das Blut frei tropfen in eine Microtainer Serumtrennröhrchen. Drücken Sie vorsichtig auf Nick mit einem saugfähigen Material, wie zB Gaze oder ein Handtuch, um den Blutfluss zu stoppen. Lassen Sie die Blutgerinnung in den Microtainer für 30 Minuten, dann zwischen 6-15 x 1.000 g zentrifugieren für mindestens 90 Sekunden. Getrennt Serum Transfer vom Microtainer in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen fürLagerung bei -80 ° C. 4,2 Saliva Halten Sie den narkotisierten Maus vertikal beim Pipettieren 20-30 ul sterilem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zwischen Wange und Zahnfleisch. Sammeln Sie die verdünnte Speichel durch Leiten Pipettenspitze zwischen Wange und Zahnfleisch. Übertragen Sie die verdünnte Speichel in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. 4,3 Nasensekret Einschläfern Maus vor dem Sammeln Nasensekret, mit zugelassenen IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Halten Sie die Maus vertikal, sorgfältig pipettieren 30 ul sterilem PBS in ein Nasenloch und sammeln spülen aus anderen Nasenloch. Übertragen Sie spülen in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. 4,4 Vaginalsekret Legen Sie die Spitze einer Mikropipette in die Öffnung des the Vulva einer Maus eingeschläfert werden, spülen Sie die Vagina mit 50 ul sterilem PBS und sammeln Sie alle Flüssigkeit durch Mikropipette. Übertragen Sie spülen in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. 5. Antigen-spezifische Antikörper oder Cytokine in den gesammelten Proben können mittels ELISA oder einem anderen quantitativen Verfahren gemessen werden. 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 enthält eine allgemeine Schema der Schritte mit der Verarbeitung des NALT-haltige Gewebe für Ex-vivo-Analyse beteiligt. In 2 (A, B), wird die Größe des Gaumens dargestellt, sowie die Lage des den Schnitt während Ablationschirurgie (A), wie durch die gestrichelte Linie angedeutet. Die Lage des NALT sind durch Pfeile in der Prämolaren-Bereich auf einem ausgeschnittenen Hämatoxylin-gefärbten Gaumen in Abbildung 2 (C) und zeigt die parallel Gewebe angegeben. Abbildung 3werden die erforderlichen Schritte des NALT Störungen Operation zeigt Exposition der oberen Gaumen für den Zugang zu NALT (A, B), Ablation (C) und ein abschließendes Ätzung der Einschnitt (D). Eine typische H & E Querschnitt der Nasenhöhle Umgebung des NALT vor der Operation wird in 3E gezeigt, während ein Bild der NALT Störung durch die microcurette direkt nach der Operation wird in 3F. Ausreichend Zeit zur Erholung von der Operation, sollten die Einschnitte geschlossen werden und der Nasenhöhle frei von NALT (3G). Typische experimentellen Ergebnisse unter Verwendung dieser Techniken erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt ist, verglichen Gewebekultur-Überständen und biologische Proben aus einer Studie eines Staphylokokken-Impfstoff (STEBVax). Die Mäuse wurden STEBVax durch intranasale (IN) oder intraperitoneale (IP) verabreicht werden. Der Impfstoff wurde mit einem Adjuvans, das die Toll-like Rezeptor 4-Weg 3,1 aktiviert formuliert 4, und Kontrollen wurden nur Kochsalzlösung oder Impfstoff ohne Adjuvans gegeben. Cultured NALT aus experimentellen Gruppen erhalten sezernierte Antigen-spezifische Immunglobuline in Medium, das mittels ELISA messbar war. In diesem Beispiel (Abbildung 4A), zeigen die Ergebnisse, dass die größten Mengen an IgA durch NALT von Mäusen, geimpft, mit einer Subunit-Impfstoff mit Adjuvans erhalten wurden, wurden freigelassen. Biologische Proben (z. B. Serum, Speichel, Nasensekret, Vaginalsekret) von der Steuerung oder NALT-freien Mäuse erworben werden verwendet, um die in vivo Immunantwort auf Antigene nasal zum Vergleich mit den Gewebekulturen Ergebnisse Profils sein. In 4B Antworten IgA und IgG, um bei der Impfung waren signifikant ohne funktionelle NALT gesunken. Mengen an Antigen-spezifischen IgA waren im Allgemeinen größer als IgG in Schleimhautsekreten (Speichel, Nasenspülungen) der geimpften Mäuse. upload/3960/3960fig1.jpg "/> Abbildung 1. Schematische Darstellung der NALT Sammlung und ex vivo kultiviert. 2. Visualisierung der Maus Gaumen, die die Position NALT und Chirurgie Schnitt. Größe und Lage der oberen Gaumen mit einer Operation Schnitt durch die gestrichelte Linie (A) bezeichnet; oberen Gaumen herausgeschnitten (B) oder gefärbt in Hämatoxylin (C), die parallel NALT im Bereich der Prämolaren Gaumen (dunkel gebeizt violett auf vorderen Seite des Gaumens sehen ). NALT durch Pfeile angedeutet. Abbildung 3. Chirurgische NALT Störung. Wichtigsten Phasen der Unterbrechung NALT Chirurgie: Rückenlage Blick Maus oberen Gaumen vor der Operation (A); Medianschnitt am oberen Gaumen gemacht, um die NALT (B) zuzugreifen; microcurette Sonde durch Medianschnitt eingefügt, um Struktur in NALT störenIntegrität (C); Kauterisation der Schnitt am Schluss der Operation (D). Mikroskopische Aufnahmen von Nasenhöhlen, H & E gefärbten, vor der Operation (E); unmittelbar nach der Operation (F) und ein erfolgreich geheilt, NALT-freie Maus (G). Abbildung 4. Impfstoff-spezifischen Antikörpern aus kultivierten NALT, Speichel, Nasensekret und von geimpften Mäusen gesammelt. NALT-freien oder normalen Mäusen der Kontrollgruppe wurden in IP oder mit STEBVax geimpft und biologischen Proben wurden gesammelt. Antikörper-Konzentrationen der Proben in dreifacher Ausfertigung wurden mittels ELISA gemessen. (A) NALT wurden aus Mäusen der Kontrollgruppe (nicht chirurgisch manipuliert) entnommen und kultiviert, um die Antikörper-Reaktionen zu untersuchen. Der Impfstoff-spezifischen IgA-Antwort in Kultur in geimpften Mäusen war statistisch signifikant von den Kontrollen (Student-t-Test, p ≤ 0,01 im Vergleich zu ohne Adjuvans oder keinen Impfstoff). (B) NALT Störungen wesentlich reduziert spezifischen Antikörper-Antwortenum bei der Impfung. Es zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den spezifischen Antikörper-Spiegel von NALT-und NALT +-Gruppen (keine Operation oder Steuerung Chirurgie) für alle Vergleiche außer Speichel IgG Ergebnisse (Student t-Test, p ≤ 0,05).