Рассматривая роль носоглотки связанных лимфоретикулярных тканей (NALT) в мышь Ответы на вакцины

1. NALT сбора и культивирования Усыпить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT. Передача мышей асептических рабочей области или биобезопасности кабинета. Снимите нижнюю челюсть мышью и очистить верхнюю часть неба со спиртом и йодом салфетки. Используйте № 11 хирургические лезвия в хирургической ручкой ножа аккуратно вырезать и акцизов верхнего неба, следуя внутри контура мышь резцы и коренные зубы. Аккуратно отогните неба пинцетом, стараясь не порвать пасть. Этот шаг необходим для снижения загрязнения культур и предназначен для обработки нескольких вкус. Место неба в отдельных скважинах в первом столбце стерильных 48-луночного планшета предварительно заполнены 250 мкл полной культуральной среде (37 ° C), состоящей из RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг / мл стрептомицина, 100 UI / мл пенициллина, 50 мкг / мл гентамицинаи 1 мкг / мл Fungizone / амфотерицин. СМИ должны быть буфером, если карбонат неба культивируют в 5% CO 2/95% влажного воздуха инкубатор (37 ° C), или же использовать 10 мМ HEPES рН 7,4, для не-CO 2 культуру. Для мытья вкус, используйте щипцы для перемещения неба в каждом последующем также в ряд, аккуратно нажав пластину между мойками, до неба прошел в общей сложности восемь стирок. Передача неба в новую стерильную 48-луночного планшета, содержащие 250 мкл свежей, полной культуральной среде (37 ° C) в скважинах. Поместите чашки, содержащие неба в 37 ° C инкубатор для культивирования в течение всего срока обучения. Сбор образцов для анализа асептической передачи 100 мкл среды от культуры скважин в Эппендорф трубы каждые 24 часа, заменяя 100 мкл свежей 37 ° С культуральной среды. Центрифуга культуры образцы печатных носителей на 380 мкг в течение 10 минут, 4 ° C, для мусора гранулу. Перенести супернатант центрифугируют от образца к свежим труб Eppendorf и хранить при температуре -20 ° C до готовности анализа. Антиген-специфические IgG, IgM, IgA и, или выделяются цитокины измеряется в ткани культуральной жидкости по стандартной иммуноферментного анализа (ИФА). 2. Хирургическое Удаление NALT Женский BALB / с мышами, от 7 до 9-недельного возраста, пригодные предметы, но и другие штаммы также являются приемлемыми. Обеспечить гелеобразной влажный корм за три дня до операции, чтобы акклиматизироваться мыши к пище и воде замену, которая будет проводиться после операции. Администрирование одна капля Metacam боли препаратов (1,5 мг / мл или 0,05 мг / вывода) в полости рта до операции. Обезболить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства, например, кетамин, acepromazine и ксилазина смеси (KAX) и применить мазь Puralube ветеринара на глаза для предотвращения высыхания. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT.nesthesia может быть подтверждено отсутствие рефлекса ответ на нежный защемления пальцев ног. Администрирование 1 мл физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида инъекций USP) подкожно между лопатками использованием 22-28 иглой и шприцем для предотвращения потенциальных обезвоживания мыши после операции. Кроме того, управление 0,1 мл подкожно Respiram между лопатками использованием 22-28 иглой и шприцем по пропаганде здорового дыхания во время и после операции. Обеспечить тепловой поддержки мыши в течение всех последующих манипуляций. Положите под наркозом мыши в горизонтальном положении, а также использовать два отдельных петель хирургического шва вокруг верхних и нижних резцов мягко взломать рот, обнажая верхнее небо. Используйте № 11 хирургические лезвия, чтобы сделать разрез приблизительно 3 мм в длину вдоль средней линии верхнего неба в месте NALT. Вставьте 0,5 мм microcurette в разрез и аккуратно соскоблить по краямнарушить NALT. Прижечь разрез, чтобы остановить кровотечение с прямой тонкой петлей на тепловую единицу прижигания. Продолжить поддержку в то время как тепловые мышь возвращается в полном сознании и деятельности. Обеспечить мыши подкожно физиологический раствор до трех раз в день, 1 мл на инъекцию между лопатками, чтобы предотвратить обезвоживание при необходимости и устные обезболивающие один раз в день в течение 3 дней после операции. Определить обезвоживание, выполнив тест кожи палатки для проверки тургор кожи. Возьмитесь за кожей и мехом между плечами лопасти так, чтобы она палаточный вверх. Если кожа быстро возвращается к нормальному, предыдущее положение, мышь не обезвожен. Если кожа остается повышенным, и движется медленно, мышь находится в состоянии обезвоживания и требует физиологического раствора. Обеспечить влажные корма, по крайней мере три дня после операции, чтобы обеспечить достаточное время для восстановления. До любой экспериментальной процедуры, соблюдать мышей в течение 8-10 дней, отслеживая веса. Плохо восстановления весаобычно указывает на неполное заживление неба, и эти мыши должны быть выведены из дальнейших исследований. 3. Подготовка NALT для гистологии и оценки успешности хирургии NALT Успех NALT операции должны быть установлены по гистологии, как описано ниже. После завершения всех экспериментальных исследований, подготовки мышей черепной коллекций эвтаназии с использованием утвержденных IACUC руководства. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT. Возьмитесь за затылок из эвтаназии мыши. Снимите нижнюю челюсть от остальной части черепа на Ножницы по мыщелкового процессов с ножницами с обеих сторон. Начиная с затылка, снять кожу и мех с черепом на медленно слезать и резать на вентральной стороне черепа. Осторожно снимите кожу вокруг носовой области и отрезать кожу от кончика морды до полностью удалить. Снимите черепа с позвонками остроумиега надрез на ножницы. Вставить ножницы в большое затылочное отверстие и сократить наполовину черепа по средней линии, чтобы проникновения формалина в мягкие ткани во время фиксации. Исправить черепа в 10% нейтральном буферном растворе формалина (НБФ) в течение 24 часов при комнатной температуре. Чтобы удалить известковые отложения, поместить образец и отдельные кассеты, завернутый в марлю, чтобы предотвратить Rexyn от прикосновения к кости, в бутылке с муравьиной кислотой смеси. Выдержите в течение 12 часов при комнатной температуре, затем смойте непрерывно в проточной воде в течение примерно 20 минут. Обрежьте образца перегородки и прошлое орбиты глаз бритвой. Примеры и кассеты могут быть сохранены для краткосрочных на 10% НБФ. Поместите образец на ткань на ночь процессор обработки. Это делается для удаления воды из образца в рамках подготовки к парафин вложения. Удалить обработанные ткани, использования на парафиновых блоков с мордой вниз, и дайте ему остыть. Обрежьте тух 15 мкм сечения блока с автоматизированной микротома, приближаясь к приблизительное местоположение NALT, а затем продолжить резки в разделах 5 мкм для монтажа на стеклах в 44.3 ° C на водяной бане. Гематоксилином и эозином (H & E) гистологической окраски должны быть использованы для оценки NALT абляции. 4. Сбор биологических образцов от мышей 4,1 сыворотки Тщательно подъемные температуры тела с тепловой лампой увеличится приток крови. Сбор крови уменьшение поперечного сечения боковой хвостовую вену с помощью хирургического ножа. Позвольте крови капать свободно в Microtainer сыворотки трубы сепаратор. Применить мягкое давление на ник с абсорбирующим материалом, таким как марлю или полотенце, чтобы остановить поток крови. Дайте крови свернуться в Microtainers в течение 30 минут, затем центрифуги между 6-15 х 1000 г, по крайней мере 90 секунд. Передача отделить сыворотку от Microtainer в чистую пробирку Eppendorf дляхранение при температуре -80 ° C. 4,2 Слюна Держите под наркозом мыши вертикально, а пипетки 20-30 мкл стерильного фосфатного буфера (PBS) между щекой и десной. Соберите разбавленной слюной, направляя пипетки между щекой и десной. Передача разбавленной слюной в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C. 4,3 носа Эвтаназии мышь перед сбором носа, с использованием утвержденных руководством IACUC. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT. Проведение мыши вертикально, аккуратно пипеткой 30 мкл стерильной PBS в одну ноздрю и собирать полоскание из другой ноздри. Передача промыть в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C. 4,4 влагалищных выделениях Вставьте кончик пипетки в открытии йэлектронной вульву эвтаназии мыши, промыть влагалище с 50 мкл стерильной PBS и собрать все жидкости микропипетки. Передача промыть в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C. 5. Антиген-специфические антитела или цитокинов в собранных образцах могут быть измерены с помощью ИФА или иной количественный метод. 6. Представитель Результаты На рисунке 1 представлена ​​общая схема действия, связанные с обработкой NALT содержащие ткани для бывших анализ естественных условиях. На рисунке 2 (А, В), размер неба показано, а также место разреза во время операции удаления (А), как показано пунктирной линией. Расположение NALT указаны стрелками в области премоляра на вырезали окрашенных гематоксилином неба на рисунке 2 (C), с указанием параллельно тканей. Рисунок 3представлены этапы NALT хирургии нарушений, показывая воздействие на верхнее небо для доступа к NALT (A, B), удаления (С), и окончательный прижигание разреза (D). Типичный H & E сечение носовой области синуса окружающих NALT до операции показана на рисунке 3E, а образ NALT срыва microcurette непосредственно после операции показан на рисунке 3F. Учитывая достаточно времени для восстановления после операции, разрезы должны быть закрыты и носовой полости лишенный NALT (рис. 3G). Типичные экспериментальные результаты, полученные с помощью этих методов показано на рисунке 4, сравнивая ткани культуральной жидкости и биологических образцов из исследования стафилококковой вакциной субъединицы (STEBVax). Мыши вводили интраназально по STEBVax (IN) или внутрибрюшинно (IP) маршруты. Вакцина была разработана с адъювантной который активирует Toll-подобный рецептор 4 пути 3,1 4 и контроля были даны только физиологическим раствором или вакцина без адъюванта. Искусственный NALT получена из экспериментальных групп выделяется антиген-специфические иммуноглобулины в среду, что было измерить с помощью ИФА. В данном примере (рис. 4а), результаты показывают, что наибольшее количество IgA были освобождены NALT, полученных от мышей, вакцинированных в с субъединицей вакцины в сочетании с адъювантной. Биологические образцы (например, сыворотка, слюна, носовые выделения, выделения из влагалища), приобретенных от контроля или NALT без мыши можно использовать для профилирования в естественных условиях иммунный ответ на антигены носовой для сравнения с результатами тканевой культуры. На рисунке 4В, IgA и IgG В ответ на вакцинацию были значительно снизилась без функциональных NALT. Уровни антиген-специфических IgA, как правило, больше, чем IgG в слизистой секрет (слюна, носовые мойки) привитых мышей. upload/3960/3960fig1.jpg "/> Рисунок 1. Схема NALT сбора и бывший культивирование естественных условиях. Рисунок 2. Визуализация мыши неба с указанием должности разреза NALT и хирургии. Размер и расположение верхнего неба с операции разрез обозначается пунктирной линией (А), верхнего неба вырезана (B) или окрашивают в гематоксилин (C), чтобы просмотреть параллельно NALT в премоляра области неба (пятна темно-фиолетового на передней стороне неба ). NALT указано стрелками. Рисунок 3. Хирургическое нарушение NALT. Основные этапы операции NALT нарушения: лежа вид мышей верхнего неба до операции (А); срединный разрез, сделанный на верхнем небе для доступа к NALT (B); microcurette зонд вводится через срединный разрез сорвать NALT структурыЦелостность (C), прижигание разреза при заключении хирургии (D). Микроскопическое изображение полости носа, H & E пятнами, до операции (E), сразу после операции (F), а также успешно исцелил, NALT без мыши (G). Рисунок 4. Вакцин, специфических антител из культивируемых NALT, слюна, носовые выделения и собраны из вакцинированных мышей. NALT свободного или нормальных мышей контроль были вакцинированы или IP с STEBVax и биологические образцы были собраны. Уровень антител в трех образцов были измерены с помощью иммуноферментного анализа. (A) NALT были исключены из контрольных мышей (не хирургическим путем манипуляций) и культивировали для изучения антител. Вакцина конкретных IgA ответ в культуре у вакцинированных мышей статистически отличается от контроля (Стьюдента-тест, р ≤ 0,01, по сравнению с отсутствием адъювантной вакцины или нет). (B) NALT нарушения существенно сократить конкретных антителВ к вакцинации. Существовали значительные различия между отдельными уровнями антител NALT и NALT + группы (без хирургического вмешательства или контроля операции) для всех сравнений, кроме слюны результаты IgG (Стьюдента-тест, р ≤ 0,05).