Analisar o papel dos Nasopharyngeal-associado do tecido linforreticular (NALT) nas respostas do rato para Vacinas

1. Colecção NALT e cultura Euthanize ratos usando aprovado orientação IACUC. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Transferência ratos para um espaço de trabalho asséptico ou cabine de segurança biológica. Retire o maxilar inferior do mouse e limpar a área palato superior com toalhetes com álcool e iodo. Use uma lâmina cirúrgica n º 11 no cabo da faca cirúrgica para cortar cuidadosamente e consumo do palato superior, seguindo o contorno interior dos dentes incisivos do rato e os dentes molares. Suavemente descole o paladar com uma pinça, tomando cuidado para não rasgar o paladar. Este passo é necessário para reduzir a contaminação das culturas e é desenhado para processar paladares múltiplas. Paladares lugar em poços individuais na primeira coluna de uma placa de 48 poços estéreis pré-cheias com 250 uL de meio de cultura completo (37 ° C) consistindo em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, estreptomicina 100 ug / mL, 100 UI / mL de penicilina, 50 ug / mL de gentamicinae 1 mg / mL fungizona / anfotericina. Os meios devem ser tamponadas se carbonato de paladares são cultivadas em um 5% de CO2 / 95% húmido incubadora de ar (37 ° C), ou, alternativamente, utilizar HEPES 10 mM, pH 7,4, para não-CO cultura 2. Para lavar os paladares, utilize uma pinça para mover paladares em cada poço sucessiva em uma linha, cuidadosamente tocar no prato entre as lavagens, até o palato foi submetido a um total de oito lavagens. Transfira os paladares em uma nova placa de 48 poços estéril contendo 250 uL de meio de cultura fresco, completo (37 ° C) em poços. Colocar as placas contendo os paladares numa incubadora a 37 ° C para a cultura durante a duração do estudo. Recolher amostras para análise por transferência de assepticamente 100 uL de meio de cultura a partir de poços em tubos Eppendorf a cada 24 horas, substituindo com 100 uL de 37 ° fresco meio de cultura C. Centrifugar media das amostras de cultura a 380 xg durante 10 minutos, 4 ° C, para os detritos de ressuspensão. Transferir o sobrenadante a partir da amostra centrifugada para tubos frescos Eppendorf e armazenar a -20 ° C até estar pronto para analisar. Antigénio específico IgG, IgM e IgA, ou citocinas secretadas são medidos em sobrenadantes de cultura de tecidos por padrão enzyme-linked immunosorbent (ELISA). 2. Ablação cirúrgica da NALT Fêmeas BALB / c, de 7 a 9 semanas de idade, são sujeitos adequados, mas outras estirpes são também aceitáveis. Fornecer-gel como alimento molhado três dias antes da cirurgia para se aclimatarem rato a comida e água substituto que será administrado pós-operação. Administrar uma gota de medicamento Metacam alívio da dor (1,5 mg / ml ou 0,05 mg / gota) para a cavidade oral antes da cirurgia. Anestesiar ratos usando aprovado orientação IACUC, por exemplo, com uma cetamina, acepromazina, ea mistura de xilazina (KAX) e aplicar Pomada Vet Puralube para os olhos para evitar a secagem. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Anesthesia pode ser confirmado pela ausência de resposta a um reflexo beliscadura suave dos dedos dos pés. Administrar 1 ml de solução salina (0,9% de sódio USP injecção de cloreto) por via subcutânea entre as omoplatas usando uma agulha de calibre 22-28 e seringa para evitar a desidratação potencial do rato após a cirurgia. Também administrar 0,1 mL de Respiram por via subcutânea entre as omoplatas usando uma agulha de calibre 22-28 e seringa para promover a respiração saudável durante e após a cirurgia. Fornecer suporte térmico para o mouse durante todas as manipulações posteriores. Posicione o mouse anestesiados em decúbito dorsal, e usar dois loops separados de sutura cirúrgica, em torno dos incisivos superiores e inferiores suavemente para forçar a abertura da boca, expondo o palato superior. Usar uma lâmina cirúrgica No. 11 para fazer uma incisão de aproximadamente 3 mm de comprimento para baixo da linha média do palato superior no local da NALT. Insira um microcurette 0,5 mm na incisão e raspe com as bordas paraperturbar o NALT. Cauterizar a incisão para parar o sangramento com um laço direto bem em uma unidade térmica cautério. Continuar a apoiar térmico enquanto se recupera do mouse para a plena consciência e atividade. Fornecer rato com uma solução salina por via subcutânea até três vezes por dia, 1 ml por injecção entre as omoplatas, para evitar a desidratação como medicação para a dor necessário e por via oral uma vez por dia durante 3 dias pós-cirurgia. Determinar a desidratação através da realização de um teste de pele tenda para verificar turgor da pele. Agarrar a pele e pelagem entre as lâminas de ombros de modo que é tenda para cima. Se a pele rapidamente retorna para a posição normal, anterior, o rato não é desidratado. Se a pele permanece elevada e move-se lentamente, o rato se encontra num estado de desidratação e requer salina. Fornecer alimento molhado por pelo menos três dias após a cirurgia para permitir tempo suficiente para a recuperação. Antes de quaisquer procedimentos experimentais, os ratos para observar 8-10 dias seguindo o ganho de peso. Recuperação do peso pobresgeralmente indica cura palato incompleta, e esses ratos devem ser retirados estudos posteriores. 3. Preparando NALT para Histologia e avaliar o sucesso de Cirurgia NALT O sucesso da cirurgia NALT deverá ser verificado por histologia, como descrito abaixo. Depois de completar todos os estudos experimentais, preparar ratos para coleções cranianos por eutanásia utilizando aprovado orientação IACUC. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Segure a nuca do mouse sacrificados. Remover o mandíbula inferior do resto do crânio cortando através dos processos condilares com uma tesoura de ambos os lados. Começando pela nuca, retire a pele e pêlo do crânio por lentamente descascar e cortar para o lado ventral do crânio. Cuidadosamente remover a pele em torno da área nasal e cortar a pele fora da ponta do focinho para remover completamente. Retire o crânio da sagacidade vértebrasha recorte da tesoura. Insira uma tesoura no forame magno e cortar na metade do crânio ao longo da linha média para permitir a permeação de formol para os tecidos moles durante a fixação. Corrigir crânio em 10% formalina tamponada neutra (NBF) durante 24 horas à temperatura ambiente. Para descalcificar, colocar a amostra e cassete separada, envolta em gaze para evitar Rexyn de tocar no osso, em garrafa com a mistura de ácido fórmico. Incubar durante 12 horas à temperatura ambiente, em seguida, lavar continuamente sob água da torneira durante cerca de 20 minutos. Apare a amostra para o septo e órbitas passado o olho com uma lâmina de barbear. Amostra e cassete pode ser armazenado por curto prazo em NBF 10%. Coloque amostra para um processador de tecidos para o processamento durante a noite. Isto é feito para remover a água a partir da amostra, em preparação para inclusão em parafina. Remover o tecido processado, incorporar em um bloco de parafina com o focinho para baixo, e deixe-a arrefecer. Apare rOUGH 15 uM secções transversais do bloco com um micrótomo automatizado, aproximando-se a localização aproximada da NALT, em seguida, continuar o corte em 5 secções iM para a montagem em lâminas de vidro em um banho de água 44,3 ° C. Hematoxilina e eosina (H e E) de coloração histológica deve ser usado para avaliar a ablação NALT. 4. Coleta de amostras biológicas de ratos 4,1 Soro Cuidadosamente elevando a temperatura do corpo com uma lâmpada de calor irá aumentar o fluxo sanguíneo. Colher sangue por cortando a veia lateral da cauda com uma lâmina cirúrgica. Permitir que o sangue a escorrer livremente dentro de um tubo separador Microtainer soro. Aplique uma pressão suave para nick com material absorvente, como gaze ou toalha, para parar o fluxo de sangue. Permitir que a coagulação do sangue nas Microtainers durante 30 minutos, em seguida, centrifuga entre 6-15 x 1000 g durante pelo menos 90 segundos. Transferência separados soro de Microtainer para um tubo de Eppendorf limpo paraarmazenamento a -80 ° C. 4,2 Saliva Segurar o rato anestesiado verticalmente enquanto pipetagem 20-30 fosfato uL estéril tamponada (PBS) entre a bochecha ea gengiva. Coletar a saliva diluída dirigindo ponta da pipeta entre a bochecha ea gengiva. Transferir a saliva diluída a um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. 4.3 As secreções nasais Euthanize do mouse antes de recolher secreções nasais, usando a orientação IACUC aprovado. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Segurando o mouse verticalmente, com cuidado pipetar 30 uL de PBS estéril em uma narina e recolher lavar de outra narina. Transferir lavagem para um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. 4.4 As secreções vaginais Introduzir a ponta de uma micropipeta para dentro da abertura de the vulva de um mouse eutanásia, lavar a vagina com 50 mL de PBS estéril e recolher todo o fluido por micropipeta. Transferir lavagem para um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. 5. Antigénio de anticorpos específicos ou citocinas nas amostras recolhidas podem ser medidos por ELISA ou outro método quantitativo. 6. Os resultados representativos A Figura 1 fornece uma representação esquemática geral de passos envolvidos com o processamento do tecido NALT contendo para análise ex vivo. Na Figura 2 (A, B), o tamanho do palato é mostrado, bem como o local da incisão durante a cirurgia de ablação (A), como indicado pela linha pontilhada. A localização do NALT são indicadas por setas na área pré-molares em um excisado palato hematoxilina-corados na Figura 2 (C), mostrando os tecidos paralelas. A Figura 3apresenta passos da cirurgia ruptura NALT, mostrando a exposição do palato superior para o acesso a NALT (A, B), a ablação (C), e cauterização final da incisão (D). Um típico H e E secção transversal da área do seio nasal em torno do NALT antes da cirurgia é mostrado na Figura 3E, enquanto uma imagem de ruptura NALT pelo microcurette directamente após a cirurgia aparece na Figura 3F. Permitindo tempo suficiente para a recuperação de uma cirurgia, as incisões deve ser fechado ea cavidade nasal desprovido de NALT (Figura 3G). Típicos resultados experimentais obtidos usando estas técnicas são mostradas na Figura 4, comparando os sobrenadantes de cultura de tecidos e as amostras biológicas a partir de um estudo de uma vacina de subunidade estafilocócica (STEBVax). Os ratinhos foram administrados por STEBVax intranasal (IN) ou intraperitoneal (ip) rotas. A vacina foi formulada com um adjuvante que ativa o receptor Toll-like 4 vias 3,1 4, e os controlos foram dadas apenas a solução salina ou vacina sem adjuvante. NALT Cultured obtido a partir de grupos experimentais secretada específicas de antigénio imunoglobulinas em meio que era mensurável por ELISA. Neste exemplo (Figura 4A), os resultados indicam que as maiores quantidades de IgA foram libertados por NALT obtido a partir de ratinhos vacinados com uma vacina de subunidade combinado com adjuvante. As amostras biológicas (tais como saliva, soro, secreções nasais, secreções vaginais) adquiridos a partir de controlo ou NALT livres de ratinhos pode ser usado para determinar o perfil da in vivo a resposta imune a antigénios nasais para comparação com os resultados de cultura de tecidos. Na Figura 4B, IgA e IgG respostas na vacinação foram significativamente reduzida sem NALT funcional. Os níveis de antigénio específico IgA foram geralmente maior do que a IgG em secreções mucosas (saliva, lavagens nasais) de ratinhos vacinados. upload/3960/3960fig1.jpg "/> Figura 1. Esquemático de NALT recolha e cultura ex vivo. Figura 2. Visualização do palato rato que indica a posição de incisão NALT e cirurgia. Tamanho e localização do palato superior, com incisão da cirurgia indicada pela linha pontilhada (A); palato superior cortado (B) ou corados em hematoxilina (C) para ver o NALT paralelo na área pré-molar do palato (manchas roxas escuras na face anterior do palato ). NALT indicado pelas setas. Figura 3. Ruptura NALT cirúrgica. As principais fases da cirurgia interrupção NALT: vista supina do palato superior do mouse antes da cirurgia (A); incisão mediana feita em palato superior para acessar o NALT (B); microcurette sonda inserida através de uma incisão na linha média para interromper estrutura NALT emTegrity (C); cauterização de incisão na conclusão da operação (D). As imagens microscópicas das cavidades nasais e coradas H & E, antes da cirurgia (E), imediatamente após a cirurgia (F), e um sucesso curado, rato NALT-livre (G). Figura 4. Vacinas específicas de anticorpos de NALT cultivadas, saliva e secreções nasais recolhidos a partir de ratinhos vacinados. Camundongos de controle NALT livres ou normal ou foram vacinadas em IP com STEBVax, e amostras biológicas foram coletadas. Os níveis de anticorpos de amostras em triplicado foram medidos através de ELISA. (A) NALT foram removidos a partir de ratos de controlo (não manipulada cirurgicamente) e cultivadas para examinar as respostas de anticorpos. A vacina específica resposta de IgA em cultura durante Em ratinhos vacinados foi estatisticamente diferente dos controlos de (teste t de Student-, p ≤ 0,01, em comparação com nenhuma adjuvante ou nenhuma vacina). (B) uma ruptura NALT substancialmente reduzida respostas de anticorpos específicosa IN vacinação. Houve diferenças significativas entre os níveis de anticorpos específicos de NALT e NALT + grupos (sem cirurgia cirurgia ou controle) para todas as comparações, exceto resultados saliva IgG (teste t de Student, p ≤ 0,05).