쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

1. 수술의 설정 노트 수술에 앞서 수술 용품 및 악기를 소독. 각 쥐​​를위한 무균 수술에 사용되는 소모품은 계기의 배치를위한 무균 표면으로 걸 포함 시켜요되는 한 드레이프를 포함, 중앙의 X 1.5에서 0.5에 대해 미리 인하 구멍과 하나 드레이프가 쥐 위에 삽입되어야합니다 그리고 거즈. 드레이프의 사전 절단 구멍이 시궁창에 만든 절개로 정렬합니다. 수술에 필요한 악기는 봉합 재료를 절단하는 데 사용되는 가위 1 표준 쌍, 두 포셉 및 봉합사의 취급과 300 명 그들의 창과위한 미세 바늘 홀더, 그리고 칼날이있는 메스를 포함합니다. 우리는 특정 외과 재료 및 도구의 테이블에서 우리 실험실에서 사용되는 일반적인 도구를 나열했습니다. 그러나 최종 도구를 선택하면 실험자 환경 설정에 따라 달라집니다. 수술 공간을 준비합니다. 보장하기 위해 손난로 아래 100 ML 0.9 % 멸균 식염수 주머니를 놓고 그 접촉 w에서 오는 염분ith 장간막 조직은 약 37 미리 예열되어 ° C. 식염수의 대안으로, 당신은 울리는의 솔루션 또는 다른 생리 버퍼를 사용할 수 있습니다. exteriorization 절차 동안에 쉽게 액세스할 수 무균 드레이프를 소독 수술기구와 물품을 펼쳐 놓고. 또한 무균 면화 팁 applicators과 봉합의 해당 3 종류 (4-0, 5-0 및 7-0)이 필요합니다. 반드시 패키지가 자료를 멸균 처리하여 액세스할 수 있도록 미리 열립니다 만듭니다. 마지막으로, 적어도 5 분 동안 100 %의 에탄올에 immersing하여 미리 수정 플라스틱 무대를 소독. 무대 중앙에 (그림 1)에서 잘라 타원형의 구멍이있는 100mm 배양 접시입니다. Dremel 도구는 초기에 확인하고, 필요한 경우 구멍을 넓혀 사용할 수 있습니다. 구멍이 만들어진 후, 자른 비닐의 가장자리가 다른 곡물의 모래 종이를 사용하여 매끄럽게 만들어집니다. 단계는 다음 중 하나를 불활성 모델링 점토 (현지 공예품 가게에서 구입한) 또는 silic은 마지막으로 씻어되고접착제를 제기하고 부드러운 표면을 제공하기 위해 구멍의 가장자리에 추가됩니다. 조직과 연락을하기 전에하는 단계는 충분히 멸균 식염수에 씻어서해야합니다. angiogenesis의이 모델에 대해서는 일반적으로 성인 남성의 Wistar 쥐 (350 ± 25g)을 사용합니다. 다른 쥐의 변종 및 연령대 사용할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 쥐가 케타민 (80 밀리그램 / kg BW), xylazine (8 밀리그램 / kg BW) 및 아트로 핀 (0.08 밀리그램 / kg BW)와 근육내 주사를 통해 anesthetized 있습니다. 약 5 분 후 마취 효과가 확인되고 쥐의 복부 피부는 면도있다. 2. 쥐의 장간막의 Exteriorization 모델 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 미치는 뒷면 anesthetized 쥐를 둡니다. 무균 기술은 수술하는 동안 사용됩니다. 멸균 장갑을 착용하고 악기와 물품이 쥐의 조직 이외의 비 멸균 표면을 연락하는 것을 허용하지 않습니다. 잎사귀 usi을 번갈아 가며 함께 복부 영역을 청소하십시오NG 70 % 이소 프로필 및 요오드에 배어 멸균 거즈. 메스 블레이드를 사용하여 피부에 따라 소형 (약 0.75 인치) 세로 절개하고 흉골 아래 linea 알바 약 1 인치를 확인하십시오. 개구부는 절개와 일치되도록 복부 절을 통해 사전 컷 드레이프를 놓습니다. 부드럽게 절개 주위에 압력을 적용합니다. 이것은 보통 쉽게 확인할 수 있도록 충분히 작은 창자의 노출이 발생할 것입니다. 면화 팁 applicators를 사용하여 부드럽게 작은 창자의 부분을 끄집어하고 회장을 찾습니다. 장간막을 꺼냈다되면서, 그것은 부드럽게 플라스틱 단계 (그림 2)에 포함 시켜요한다. 6-8 vascularized의 mesenteric 창을 확인합니다. mesenteric 창이 작은 창자 (그림 2)을 먹이 동맥 / 정맥 쌍 사이에있는 얇은 반투명 막으로 정의됩니다. exteriorization의 시작 시간을 기록합니다. mesente를 남겨주세요공예 섹션은 20 분 동안 exteriorized. exteriorization 기간 동안 간헐적으로 조직이 포장되어 남아 밖으로 건조하지 않도록 배양 접시에있는 염분을 보충하기 위해 멸균 주사기 (5 ML)을 사용합니다. 20 분 노출 시간 동안 살균 7-0 봉합사로이 중앙에 위치 mesenteric 창을 표시합니다. 표식이 소장 근처 지방 지역에하여야한다. 복강에 장간막의 exteriorized 지역을 반환합니다. 중단 패턴에서 5-0 monofilament의 봉합과 함께 복부 근육을 닫습니다. 중단 패턴에서 4-0 monofilament의 봉합과 피부를 닫습니다. 70 % isopropoyl 및 요오드에 배어 멸균 거즈를 사용하여 잎사귀 교대로 봉합 지역을 닦아주십시오. 쥐의 두 눈에 안구 윤활제 젤 뿌리 더군요. 눈을 윤활의 목적은 수술 및 복구하는 동안 각막의 탈수를 방지하는 것입니다. 안구 윤활제의 응용 프로그램이 적용되어야외과 개입의 시작 이었읍니다. 필요하다면, 복구를 위해 자사의 창구로 쥐를 반환하기 전에 안구 윤활제를 다시 적용합니다. 3. 조직 수확 및 고정 관심 포스트 자극 당일 마취와 쥐를 안락사. 저희 연구실에서는 쥐가 beuthanasia의 intracardiac 주입을 통해 euthanized 후 근육내 케타민 (80 밀리그램 / kg BW), xylazine (8 밀리그램 / kg BW) 및 아트로 핀 (0.8 밀리그램 / kg BW)와 사출 및 경유 anesthetized 있습니다. Beuthanasia는 신속하고 고통없이 안락사에 사용할 수 pentobarbital 나트륨 / phenytoin 솔루션입니다. 0.2 ML – 쥐에 따라 저희 연구실은 일반적으로 0.1 넣을 꺼야. 복강를 다시 열고 부드럽게 작은 창자를 제거하고 두 표시된 창을 찾습니다. 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 exteriorized mesenteric 창을 각을 잘라 버릴거야. 지방마다 창의 테두리를 포함 시키면 나중에 조직은 현미경 슬라이드에 확산을위한 유리한 것입니다. 바로, PBS의 각 창에 젖어. 절단하면, 윈도우의 작성 잠재 혈액을 최소화하기 위해 창문 지방 국경 내에 동맥 / 정맥 쌍을 통해 절단되지 않도록하려고합니다. 또한 창자 내용의 결과 창에 문의하는 창자를 통해 절단 최소화. 적극적으로 청구 현미경 슬라이드에 조직을 확산하기 위해 집게를 사용하십시오. 두 조직은 슬라이드마다 설치할 수 있습니다. 조직이 부분적으로 건조하고 메스 블레이드는 과잉 지방을 제거를 사용하도록 허용합니다. 휴지는 이제 수정되어야 준비가 된 것입니다. 일반적인 고정 방법을 사용할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 30 분 동안 메탄올 (-20 ℃)​​에 슬라이드를 고정시킨다. 성공적인 상표는 또한 떼어낸 조직으로 수행되었습니다. 고정 방법은 선호하는 항체에 달려 있습니다. 4. 조직 Immunolabeling 조직은 일반적으로 지금 immunohistochemistry에 대한 항체 당 지시에 따라 분류 할 수 있습니다. 역할을 식별에서 우리의 관심을 감안할 때angiogenesis 동안 혈관 pericytes 때문에, 저희 연구실은 일반적으로 내피와 perivascular 세포 10, 12, 13 레이블. microvascular 네트워크의 계층 구조를 따라 내피 세포를 확인하는 유용한 라벨 방지 PECAM 항체 또는 BSI-렉틴입니다. 해당 조직에서 사용 Perivascular 세포 마커 NG2, desmin, SM-α actin, PDFGRβ하고, 클래스 III β-tubulin이 포함됩니다. 아래 섹션 3.3에서 우리는 colorimetric 및 형광 PECAM의 immunolabeling 프로토콜에 대해 프로토콜을 나열했습니다. 초기 일차 항체 배양에 앞서, 슬라이드 초과 완충 용액을 제거하는 건조 진공 있습니다. 또한, 조직은 처음에는 멀리 조직에서 항체 솔루션의 통제 흐름을 방지하기 위해 왁스 펜으로 설명되어 있습니다. 마지막으로, 모든 레이블링 단계 세척 단계 뒤에있다. 단계를 씻는 경우, 슬라이드는 염색법 개랑 내부에 배치됩니다. 완충 용액은 세척 기간 동안 3 번 교환을하고 있습니다. 내피 세포 항체 라벨링 절차 : <P 클래스 = "jove_step"> PECAM Colorimetric Lableing 일차 항체 배양 : 각 조직의 꼭대기에 약 100-200 ML 일차 항체 솔루션 (항체 완충액으로 희석 1:200 마우스 단클론 biotinylated CD31 항체 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌)) 똑, 전체 조직이 있는지 확인 항체 용액으로 덮여. 상온에서 1 시간 배양. 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. 차 항체 보육 : 똑 이차 항체 용액 (벡터 Laboratories의 VECTASTAIN 엘리트 ABC 솔루션, streptavidin 퍼옥시데이즈 이차 항체 용액) 조직의 꼭대기에서. 1 시간 정도 실온에서 품어. 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. 15 분 동안 벡터 노바 레드와 조직을 품어. 그런 다음 물로 조직이 떠오 릅니다. 마운트 슬라이드 : 95 %의 에탄올에서 물놀이 슬라이드 10 배. 잠그다 2 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드. 또 100 % 에탄올에 잠그다 슬라이드하므로2 분 대한 lution. 그럼 이분 각각 연속 100 % 크실렌 솔루션에 잠그다 슬라이드. VectaMount의 얇은 레이어와 coverslip으로 조직을 건조하고 커버하도록 허용합니다. PECAM 형광 라벨 일차 항체 배양 : 각 조직의 꼭대기에 약 100-200 ML 일차 항체 솔루션 (항체 완충액으로 희석 1:200 마우스 단클론 biotinylated CD31 항체 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌)) 똑, 전체 조직이 있는지 확인 항체 용액으로 덮여. 상온에서 1 시간 배양. 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. 차 항체 보육 :. 조직의 꼭대기에서 똑 이차 항체 솔루션 ((1:100 Streptavidin-CY3가 (PBS + 2퍼센트 BSA의 0.1 %의 사포닌) 항체 완충액으로 희석) 1 시간 동안 실온에서 품어. 30 분 PBS 0.1 %의 사포닌과 조직 씻으십시오. 마운트 슬라이드 : 조직의 꼭대기에서 글리세롤과 함께 50:50 PBS를 똑. 엄호커버 슬립으로. 그런 다음, 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 격차를 봉인 매니큐어가 손톱도 사용. 5. 대표 결과 immunohistochemically PECAM에 대한 레이블이 붙은 쥐의 장간막 조직의 대표 이미지는 그림 3에 표시됩니다. PECAM 라벨은 microvascular 네트워크를 리모델링의 계층 구조를 따라 모든 선박 유형을 식별하고 특정 시간 지점 포스트 자극에 angiogenic 통계를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. PECAM 라벨은 또한 arterioles 대 venules의 결정을 허용합니다. 수유 arterioles 일반적으로 이점 venules (그림 4)에 비해 더 작은 직경과 길쭉한 내피 세포 형태를 나타냅니다. 모세 혈관과 모세 새싹들은 혈관의 직경 및 네트워크 내의 상대 위치를 기반으로 확인할 수 있습니다. 리모델링 네트워크의 일반적인 특성은 증가 돋아 모세관, 선박 밀도, vascularized 지역 및 venular tortuos 포함ity. 다양한 angiogenic 통계 부량는 네트워크의 성장 (그림 5)의 시간 코스를 식별합니다. 3 일 및 5 일째와 10 일째에 의해 unstimulated 수준으로 돌아갑니다 간의 기존 선박, 봉우리에서 돋아 모세관. 돋아의이 일시적 증가는 혈관 밀도와 vascularized 지역의 증가 뒤에있다. 이 모델의 큰 혈관의 리모델링에 대한 증거로서, arteriole과 venule 세그먼트의 숫자도 시간에 걸쳐 증가한다. 저희 연구실에서는이 모델이 개조 과정 10, 11 중 특정 시점에서 세포 phenotypic 변화를 식별하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 클래스 III β-tubulin은 angiogenic 혈관을 따라 pericytes (그림 6)를 식별합니다. unstimulated 조직에서, 클래스 III β-tubulin 표현은 신경 다릅니다. 대조적으로 돋아 모세관의 정상 동안, 클래스 III β-tubulin은 perivascular 세포에 의해 표현된다. 이러한 유형의결과의 angiogenic 과정에 참여 소설 셀 유형을 식별하려면이 간단하고 강력한 angiogenic 모델의 사용을 강조 표시합니다. 그림 1. 플라스틱 무대 전후 수정의 이미지. 미리 수정된 무대 100mm 배양 접시입니다. 수정 중앙에 타원형의 구멍 잘라내기, 제기, 부드러운 표면의 생성을위한 구멍의 가장자리 모델링 찰흙이나 실리콘 접착제의 후속 또한 포함됩니다. 이것은 표면 exteriorized mesenteric 창이의 superfusion을 용이하게 내부 경계를 제공합니다. 스케일 바는 1cm입니다. 그림 2. exteriorized mesenteric 지역의 이미지. Mesenteric 창문은 작은 창자를주고 동맥 / 정맥 쌍 사이의 얇은 반투명의 세포막으로 정의됩니다. exteriorization 동안시간, mesenteric 지역은 뻗어 및 수정된 배양 접시 안에 식염수로 포장되어 있습니다. 불활성 노란색 모델링 클레이는 사전 컷 구멍을 통해 뽑았되는 장간막에 대한 매끄러운 표면을 제공합니다. 스케일 바는 1cm입니다. 그림 3. unstimulated 조직 및 조직 3과 장간막 10 일 포스트 exteriorization에서 mesenteric microvascular 네트워크의 대표 이미지. PECAM 라벨이 arterioles (), venules (V)과 모세 혈관 (C)을 포함한 microvascular 네트워크의 계층 구조를 식별. 게시 자극은 microvascular 네트워크 모세관 돋아 (화살표 머리)와 혈관 밀도의 증가를 표시합니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. 성인 쥐 mesenteric의 microvascular 네트워크 내에서 arteriole / venule 쌍 그림 4. 대표 이미지의. 두 이미지에서 arterioles ()은 작은 상대적인 직경 길쭉한 내피 세포 형태학에 근거 venules (V)에서 구분 할 수 있습니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. 그림 5. microvascular 성장 포스트 장간막의 exteriorization의 시간 코스 이상의 angiogenic 통계 대표 부량. 조직 면적 당) 혈관 공간이 있습니다. 혈관 면적 당 모세관 새싹 B) 번호. 혈관 면적 당 C) 총 혈관 길이. * unstimulated 그룹에 비해 상당한 차이를 나타냅니다. 통계 비교는 던의 시험 다음 편도 ANOVA를 사용하여 만들어 졌 었죠. (P <0.05). 유엔 unstimulated 나타냅니다. 그림 6. 3, 10시 unstimulated 조직 및 조직의 mesenteric microvascular 네트워크 대표 형광 이미지일 장간막의 exteriorization을 게시할 수 있습니다. Immunofluorescent PECAM 라벨 (빨간색)은 내피 세포를 식별하고, 클래스 III β-tubulin 라벨 (녹색)는 신경 (화살표 머리)와 perivascular 세포 (화살표) 식별합니다. Perivascular 세포는 transiently 돋아 모세관 중에 클래스 III β-tubulin을 upregulate. unstimulated microvascular 네트워크에서는, 클래스 III β-tubulin은 신경 구체적이고 perivascular 세포를 식별하지 않습니다. 삼일 포스트 자극, 클래스 III β-tubulin은 긍정적 microvessels 따라 perivascular 세포를 표시합니다. 10 일째함으로써, 클래스 III β-tubulin 표현 패턴 unstimulated 시나리오로 돌아갑니다 시작한다. 스케일 바는 50 μm의입니다. 그림 7. 장간막의 exteriorization에 의해 자극을 microvascular 네트워크 성장하는 동안 추적 미리 표시된 로컬로 적용 세포의 가능성을 지원하는 이미지. 세포 mesenter 이상 superfused되었습니다20 분 exteriorization 기간 동안 IC 창. 일일 수술 후, DiI 라벨 세포 (적색)은 PECAM 긍정 microvessels (녹색)와 여자 초점 평면에서 관찰되었다. DiI 분류 골수 세포, B) 예 morphologies를 반올림하고 늘어나지 출전. 어떤 경우에는 (화살표) 세포 microvessels 따라 늘어나지되었다. C) DiI의 클러스터의 예 (화살표) 새싹 모세관의 끝부분 근처 mesenchymal 줄기 세포를 분류. 스케일 바는 50 μm의 (), 및 20 μm의 (B, C)입니다.