Rat mesenterium uittreding: een model voor het onderzoeken van de Cellular Dynamics betrokken bij het Angiogenese

1. Chirurgische Procedure Set-Up Notes Voorafgaand aan de operatie steriliseren chirurgisch materiaal en instrumenten. Diensten gebruikt voor steriele chirurgische procedure voor elke rat omvatten een gordijn worden aangelegd als een steriel oppervlak voor de plaatsing van instrumenten, een laken met een voorgesneden gat 0,5 cm x 1,5 in het midden geplaatst boven de rat en gaas. De voorgesneden gat in het laken zal zich aanpassen aan de incisie gemaakt op de rat. Instrumenten voor de operatie behoren een standaard schaar gebruiken om hechtmateriaal snijden, twee tang en een fijne naald houder voor het hanteren en grijpen van het hechtmateriaal en een scalpel een mes. Wij hebben de gemeenschappelijke instrumenten gebruikt door ons laboratorium in de tabel van specifieke chirurgische materialen en gereedschappen. Echter, de uiteindelijke keuze van gereedschap hangt af van experimentator voorkeuren. Bereid de operatie ruimte. Plaats een 100 ml 0,9% steriele zoutoplossing zak onder een verwarmingselement dat de zoutoplossing dat in contact komt wet het mesenterium weefsel verwarmen tot ongeveer 37 ° C. Als alternatief voor zout kunt u Ringer's oplossing of een andere fysiologische buffer. Indeling gesteriliseerde chirurgische instrumenten en voorraden aan een steriel laken voor een gemakkelijke toegang tijdens de uittreding procedure. Ook moet u steriel wattenstaafje applicators en de juiste 3 soorten hechtingen (4-0, 5-0 en 7-0). Zorgt ervoor dat pakketten worden zo vooraf geopend dat de materialen kan worden benaderd met een steriele behandeling. Tenslotte desinfecteren pre-gemodificeerde kunststof fase door onderdompelen in 100% ethanol gedurende minstens 5 minuten. De fase is een 100 mm Petrischaal met een elliptische gat in het midden (figuur 1). Een Dremel kan worden gebruikt in eerste instantie te maken en zo nodig te verbreden het gat. Nadat het gat is gemaakt, zijn de randen van de uitsparing plastic glad gemaakt met schuurpapier verschillende graansoorten. De fase wordt vervolgens gewassen en tenslotte een inert klei (gekocht bij een handwerk slaan) SILICop lijm wordt toegevoegd aan de rand van de opening in om een ​​verhoogd, glad oppervlak. Voorafgaand aan contact met het weefsel, het stadium moet voldoende zijn gespoeld met steriele zoutoplossing. Voor dit model van angiogenese, Wij gebruiken meestal de volwassen mannelijke Wistar ratten (350 ± 25 g). Andere ratten stammen en leeftijden kan worden gebruikt. In ons laboratorium ratten zijn verdoofd via een intramusculaire injectie met ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht), xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht), en atropine (0,08 mg / kg lichaamsgewicht). Na ongeveer 5 minuten, wordt het effect van de anesthesie bevestigd en de rat buikhuid wordt geschoren. 2. Rat mesenterium uittreding Model Plaats de verdoofde rat op zijn rug op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven. Aseptische technieken worden gebruikt tijdens de chirurgische ingreep. Draag steriele handschoenen en staan ​​niet toe dat instrumenten en leveringen aan niet-steriele andere oppervlakken dan de rat weefsels contact op te nemen. Maak buikstreek met afwisselende doekjes using van de steriel gaasje gedrenkt in 70% isopropyl en jodium. Met behulp van de scalpel, maak een klein (ongeveer 0,75 inch) longitudinale incisie langs de huid en vervolgens de linea alba ongeveer 1 cm onder het borstbeen. Leg de voorgesneden laken over de buik gedeelte, zodat de opening uitgelijnd met de incisie. Voorzichtig brengen druk aan rond de incisie. Dit zal gewoonlijk leiden tot blootstelling van de dunne darm genoeg is om gemakkelijk te worden geïdentificeerd. Met behulp van de katoen tip applicators, trek een deel van de dunne darm en zoek het ileum. Aangezien het mesenterium wordt getrokken moet voorzichtig worden aangelegd in de kunststof fase (figuur 2). Identificeer 6-8 gevasculariseerd mesenteriale ramen. Een mesenteriale venster wordt gedefinieerd als de dunne doorzichtige membraan tussen de arterie / ader paren toevoeren van de dunne darm (figuur 2). Noteer de begintijd van uittreding. Laat de mesentery sectie exteriorized gedurende 20 minuten. In de uittreding periode een steriele injectiespuit (5 ml) om het zout intermitterend vullen in een petrischaal aan dat het weefsel is ondergedompeld en niet uitdroogt. Tijdens de 20-minuten belichtingstijd, markeer de twee centraal gelegen mesenteriale ramen met steriele 7-0 hechtdraad. De merktekens worden gemaakt in het vet omgeving van de darm. Zet de exteriorized regio van het mesenterium naar de buikholte. Sluit de buikspier met 5-0 monofilament hechtdraad in onderbroken patroon. Sluit de huid met 4-0 monofilament hechtdraad in onderbroken patroon. Veeg de gehecht gebied met afwisselende vochtige doekjes via het steriel gaasje gedrenkt in 70% isopropoyl en jodium. Verspreid het oog glijmiddel op beide ogen van de rat. Het doel van smeren oog het drogen van de cornea voorkomen tijdens operatie en herstel. De toepassing van oog smeermiddel dient te worden toegepastvoor het begin van de chirurgische ingreep. Indien nodig, voordat opnieuw toe te passen eye smeermiddel wel terugbetaling van de rat om zijn kooi voor herstel. 3. Tissue Oogst en fixatie Op de dag van belang na de stimulatie, verdoven en euthanaseren van de rat. In ons laboratorium ratten zijn verdoofd via een intramusculaire injectie met ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht), xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht), en atropine (0,8 mg / kg lichaamsgewicht) en vervolgens gedood door intracardiale injectie van beuthanasia. Beuthanasia een natriumpentobarbital / fenytoïne oplossing kan worden gebruikt voor snelle en pijnloos euthanasie. Per rat ons laboratorium injecteert meestal 0,1 tot 0,2 ml. Heropen de buikholte en verwijder voorzichtig de dunne darm en zoek de twee gemarkeerde ramen. Knip elk van de exteriorized mesenteriale vensters met behulp van een tang en micro-schaar. Inclusief een grens van vet per venster is voordelig voor later weefsel verspreiden op objectglaasjes. Onmiddellijk, Dompel elk venster in PBS. Bij het snijden, probeer te voorkomen dat het doorsnijden van slagader / ader paren in het vet grens van de ramen om potentiële bloed vulling van de vensters te minimaliseren. Ook een minimum te beperken dwars door de darm die resulteert in darminhoud de ramen contact op te nemen. Gebruik een tang om weefsels te verspreiden op de positief geladen objectglaasjes. Twee weefsels kan worden gemonteerd per dia. Laat het weefsel gedeeltelijk drogen en met behulp van een scalpel verwijdert het teveel aan vet. Weefsels zijn nu klaar om te worden vastgesteld. Typische fixatie methoden kunnen worden gebruikt. In ons laboratorium men gewoonlijk vast de glaasjes in methanol (-20 ° C) gedurende 30 minuten. Succesvolle etikettering is ook uitgevoerd met de niet vastgelegde weefsels. Fixatie methodes zou kunnen is afhankelijk van uw voorkeur antilichaam. 4. Tissue immunokleuring Weefsels kunnen nu algemeen worden voorzien volgens de instructies per antilichaam voor immunohistochemie. Gezien onze interesse in het identificeren van de rollenvan vasculaire pericyten tijdens angiogenese, ons laboratorium labelt vaak voor endotheliale en perivasculaire cellen 10, 12, 13. Nuttig labels aan endotheelcellen te identificeren aan de hiërarchie van de microvasculaire netwerken zijn een anti-PECAM antilichaam of BSI-lectine. Perivasculaire cel markers gebruikt in dit weefsel zijn NG2, desmine, SM-α actine, PDFGRβ, en klasse III β-tubuline. Hieronder, in paragraaf 3.3, hebben we vermeld protocollen voor kleur-en tl-PECAM immunokleuring protocollen. Vóór de eerste primaire antilichaam incubatie glijbanen vacuum gedroogd om overmaat bufferoplossing te verwijderen. Ook zijn weefsels in eerste instantie aangegeven met een wax pen tot een ongecontroleerde stroom van antilichaam-oplossingen te voorkomen dat uit de buurt van het weefsel. Tenslotte worden alle stappen labelen gevolgd door wasstappen. Voor het wassen van stappen, worden dia's geplaatst in vlekken potten. De bufferoplossing wordt uitgewisseld 3 keer wassen van de duur. Endotheelcellen antilichaam etiketteringsprocedures: <p class = "jove_step"> PECAM colorimetrisch Lableing Primaire antilichaam incubatie: Drip ongeveer 100-200 ml primaire antilichaam-oplossing (1:200 muis monoklonaal antilichaam gebiotinyleerd CD31 antilichaam verdund in buffer (0,1% Saponine in PBS + 2% BSA)) op de top aan elk weefsel, zorg ervoor dat het hele weefsel is bedekt met antilichaam oplossing. Incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten. Secundair antilichaam incubatie: Drip secundair antilichaam-oplossing (VECTASTAIN Elite ABC oplossing van Vector Laboratories, een streptavidine-peroxidase tweede antilichaam-oplossing) op de top van de weefsels. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten. Incubeer weefsels met Vector Nova Rode gedurende 15 minuten. Dan stijgen weefsels met water. Mount dia's: Dip dia's in 95% ethanol 10 keer. Dompel dia's in 100% ethanol voor 2 minuten. Dompel de glaasjes in nog eens 100% ethanol, zodatlutie voor 2 minuten. Dan dompelen dia's in opeenvolgende 100% xyleen oplossingen voor elk 2 minuten. Laten drogen en weefsels bedekken met een dunne laag VectaMount en een dekglaasje. PECAM fluorescentielabelling Primaire antilichaam incubatie: Drip ongeveer 100-200 ml primaire antilichaam-oplossing (1:200 muis monoklonaal antilichaam gebiotinyleerd CD31 antilichaam verdund in buffer (0,1% Saponine in PBS + 2% BSA)) op de top aan elk weefsel, zorg ervoor dat het hele weefsel is bedekt met antilichaam oplossing. Incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten. Secundair antilichaam incubatie. Druppel secundair antilichaam oplossing ((1:100 Streptavidine-CY3 verdund in antilichaam (0,1% saponine in PBS + 2% BSA)) op weefsels incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten. Mount dia's: Drip 50:50 PBS met glycerol op de top van de weefsels. Dekkenmet dekglas. Gebruik vervolgens nagellak om de kloof tussen dekglas en schuif af te sluiten. 5. Representatieve resultaten Representatieve beelden rat mesenterium weefsels immunohistochemisch gemerkte PECAM weergegeven in figuur 3. PECAM etikettering identificeert alle types schepen langs de hiërarchie van de verbouwing microvasculaire netwerken en kan worden gebruikt om de angiogene statistieken op specifieke tijdstippen na stimulatie te kwantificeren. PECAM etikettering kunnen ook voor de bepaling van de arteriolen versus venulen. Het voeden arteriolen doorgaans vertonen kleinere diameters en langwerpige endotheelcellen morfologie in vergelijking met gepaarde venulen (figuur 4). Haarvaten en capillaire spruiten kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun schip diameter en relatieve positie in een netwerk. Typische kenmerken van remodeling netwerken zijn onder andere verhoogde capillaire kiemen, vaatdichtheid, gevasculariseerde gebied en venular tortuosheid. Kwantificering van verschillende angiogene metrics identificeert het tijdsverloop van de groei van het netwerk (figuur 5). Capillair ontspruit uit reeds bestaande schepen, pieken tussen dag 3 en dag 5 en keert terug naar de ongestimuleerde niveau op dag 10. Deze tijdelijke verhoging van de kiemen wordt gevolgd door stijgingen van de vasculaire dichtheid en gevasculariseerd gebied. Als bewijs voor de verbouwing van grotere schepen in dit model, het aantal arteriole en venule segmenten verhoogt ook over de tijd natuurlijk. In ons laboratorium is dit model is gebruikt om cellulaire fenotypische veranderingen op specifieke tijdstip te identificeren tijdens deze verbouwing proces 10, 11. Bijvoorbeeld, klasse III β-tubuline identificeert pericyten langs angiogene schepen (figuur 6). In ongestimuleerde weefsels, klasse III β-tubuline expressie is zenuw specifiek. In tegenstelling, tijdens de piek van capillaire kiemen, is klasse III β-tubuline uitgedrukt door perivasculaire cellen. Dit typeresultaat belicht de toepassing van deze eenvoudige en robuuste angiogene model nieuwe celtypen bij het angiogene te identificeren. Figuur 1. Beelden van de plastic podium pre-en post-modificatie. De pre-gemodificeerde fase is 100 mm petrischaal. Wijzigingen zijn onder andere een elliptische gat gesneden in het centrum en de daarop volgende toevoeging van klei of siliconen lijm aan de rand van het gat voor de oprichting van een verhoogde, glad oppervlak. Dit oppervlak zorgt voor een innerlijke grens die superfusie van de exteriorized mesenteriale ramen vergemakkelijkt. Schaalstaaf is 1 cm. Figuur 2. Afbeelding van exteriorized mesenteriale regio. Mesenteriale ramen worden gedefinieerd als de dunne doorschijnende membranen tussen de slagader / ader paren het voeden van de dunne darm. Tijdens de uittredingduur, wordt de mesenteriale regio aangelegd en ondergedompeld in een zoutoplossing in een aangepaste petrischaal. Inert gele klei heeft een glad oppervlak voor het mesenterium worden getrokken door de voorgesneden gat. Schaalstaaf is 1 cm. Figuur 3. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de mesenteriale microvasculaire netwerken ongestimuleerde weefsels en weefsels op 3 en 10 dagen na de uittreding van het mesenterium. PECAM etikettering gewezen op de hiërarchie van microvasculaire netwerken, met inbegrip, arteriolen (A), venulen (V) en haarvaten (C). Bericht stimulatie, microvasculaire netwerken die worden vermeld een toename van de capillaire kiemen (pijlpunten) en vaatdichtheid. Schaal bar is 100 micrometer. Figuur 4. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de arteriole / venule paren binnen de volwassen rat mesenteriale microvasculaire netwerks. In beide beelden kan slagaders (A) worden onderscheiden van venules (V) op een kleinere diameter en relatief langwerpige endotheelcellen morfologie. Schaal bars zijn 20 urn. Figuur 5. Vertegenwoordiger kwantificering van angiogene statistieken over het tijdsverloop van microvasculaire groei na mesenterium uittreding. A) Vasculaire oppervlakte per weefsel gebied. B) Aantal capillaire spruiten per vasculaire gebied. C) Totale vasculaire lengte per vasculaire gebied. * Staat voor significant verschil in vergelijking met niet gestimuleerde groep. Statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van een One-Way ANOVA gevolgd door test Dunn's. (P <0,05). VN vertegenwoordigt ongestimuleerde. Figuur 6. Vertegenwoordiger fluorescerende beelden van de mesenteriale microvasculaire netwerken ongestimuleerde weefsels en weefsels op 3 en 10dagen na de uittreding van het mesenterium. Immunofluorescentie PECAM etikettering (rood) geeft endotheelcellen, en klasse III β-tubuline etikettering (groen) geeft zenuwen (pijlpunten) en perivasculaire cellen (pijlen). Perivasculaire cellen tijdelijk upregulate klasse III β-tubuline tijdens capillaire kiemen. In ongestimuleerde microvasculaire netwerken, klasse III β-tubuline is zenuw specifiek en niet te identificeren perivasculaire cellen. 3 dagen na stimulatie, klasse III β-tubuline labelt positief perivasculaire cellen langs de haarvaten. Per dag 10, klasse III β-tubuline expressie patroon begint om terug te keren naar de ongestimuleerde scenario. Schaal bar is 50 urn. Figuur 7. Afbeeldingen ondersteuning van de haalbaarheid van het bijhouden van gelabelde lokaal aangebrachte cellen tijdens microvasculaire groei van het netwerk gestimuleerd door het mesenterium uittreding. De cellen werden superfused meer dan mesenteric ramen tijdens de 20 minuten uittreding periode. 1 dag na de operatie, DII gelabelde cellen (rood) werden waargenomen in de dame brandvlak met PECAM positieve haarvaten (groen). A, B) Voorbeelden van DII gelabelde beenmergcellen exposeren rond en langwerpig morfologie. In sommige gevallen (pijlen) cellen werden verlengd langs microvaatjes. C) Voorbeeld van een cluster van DII gelabelde mesenchymale stamcellen in de buurt van de top van een capillair spruit (pijl). Schaal staven 50 pm (A) en 20 pm (B, C).