Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

1. Chirurgisches Vorgehen Set-Up Hinweise Vor der Operation zu sterilisieren chirurgisches Material und Instrumente. Zubehör für das sterilen chirurgischen Verfahren für jede Ratte verwendet werden, umfassen ein Abdecktuch an sich als eine sterile Oberfläche für die Platzierung der Instrumente gelegt werden, einem Tuch, mit einer vorgeschnittenen Öffnung etwa 0,5 x 1,5 in der in der Mitte über der Ratte platziert werden und Gaze. Die vorgeschnittene Loch auf dem Abdecktuch wird mit dem Einschnitt an der Ratte angeglichen. Instrumente für die Operation erforderlich sind 1 Standard-Schere verwendet werden, um Nahtmaterial geschnitten werden, zwei Zangen und einer feinen Nadel Halter für den Umgang mit und Greifen des Fadens, und ein Skalpell mit einer Klinge. Wir haben die gemeinsame Instrumente durch unser Labor in der Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge verwendet werden aufgelistet. Allerdings hängt endgültige Auswahl-Werkzeug auf Experimentator Präferenzen. Bereiten Sie die Operation Raum. Stellen Sie ein 100 ml 0,9% iger steriler Saline-Tasche unter einem Heizkissen um sicherzustellen, dass die Salzlösung, die in Kontakt kommt wit dem Mesenterium Gewebe wird auf ca. 37 vorgewärmt ° C. Als Alternative zur Saline, können Sie mit Ringer-Lösung oder einen anderen physiologischen Puffer. Legen Sie sterilisierte chirurgische Instrumente und Zubehör auf einem sterilen Tuch für einen einfachen Zugang während des Verfahrens Exteriorisation. Außerdem benötigen Sie sterile Wattestäbchen Applikatoren und die entsprechenden 3 Arten von Nähten (4-0, 5-0 und 7-0). Stellt sicher, dass Pakete sind so voreingestellt, dass die Materialien eröffnet mit sterile Handhabung zugegriffen werden kann. Schließlich desinfizieren zuvor modifizierten Kunststoff Stufe durch Eintauchen in 100% Ethanol für mindestens 5 Minuten. Die Bühne ist eine 100 mm Petrischale mit einem elliptischen Loch in der Mitte (Abbildung 1) zu schneiden. Ein Dremel-Tool kann verwendet werden, um zunächst zu machen und, falls erforderlich, erweitern Sie das Loch werden. Nachdem das Loch gemacht wird, werden die Ränder des Schnittes Kunststoff glatt mit Schleifpapier unterschiedlicher Körnung. Die Bühne wird dann gewaschen und schließlich entweder inert Modelliermasse (gekauft von einem lokalen Handwerks speichern) oder Silicam Klebstoff auf des Lochs Kante hinzugefügt, um einen erhöhten, glatte Oberfläche bereitzustellen. Vor mit dem Gewebe in Kontakt, wird die Stufe müssen ausreichend mit steriler Kochsalzlösung gespült werden. Für dieses Modell der Angiogenese, wir verwenden in der Regel erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g). Andere Rattenstämmen und Altersstufen verwendet werden kann. In unserem Labor sind Ratten betäubt durch intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,08 mg / kg KG). Nach ca. 5 Minuten, wird die Wirkung der Anästhesie bestätigt und der Ratte Bauchhaut rasiert wird. 2. Rattengekröse Exteriorisation Modell Positionieren Sie den narkotisierten Ratte auf dem Rücken auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Aseptische Techniken werden während des chirurgischen Eingriffs verwendet. Trage sterile Handschuhe und erlauben keine Apparaten und Materialien zu nicht-sterilen Oberflächen außer den Rattengeweben kontaktieren. Säubern Sie Bauch-Bereich mit wechselnden Tücher USIng die sterile Gaze in 70% igem und Jod getränkt. Mit dem Skalpell, einen kleinen (ca. 0,75 Zoll) Längsschnitt entlang der Haut und dann der Linea alba ca. 1 cm unterhalb des Brustbeins. Platzieren Sie die vorgeschnittenen Tuch über die abdominale Abschnitt so daß die Öffnung ausgerichtet ist mit dem Einschnitt. Durch leichten Druck um den Einschnitt. Dies wird in der Regel in der Exposition des Dünndarms genug, um es leicht identifiziert werden können führen. Mit den Wattestäbchen Applikatoren, ziehen Sie vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms und suchen Sie das Ileum. Da das Mesenterium herausgezogen wird, sollte sie vorsichtig gelegt werden, sind im Kunststoff-Stufe (Abbildung 2). Identifizieren 6-8 vaskularisierten mesenterialen Fenstern. Ein mesenterica Fenster wird als dünne durchlässige Membran zwischen den Arterien / Venen Paaren Zuführen des Dünndarms (2) definiert. Notieren Sie sich die Startzeit der Entäußerung. Verlassen Sie die mesentery Abschnitt exteriorisiert für 20 Minuten. Während der Periode Exteriorisation, verwenden Sie eine sterile Spritze (5 ml), um intermittierend füllet die Saline in der Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe eingetaucht bleibt und nicht austrocknet. Während der 20-minütigen Einwirkzeit, markieren Sie die zwei zentral gelegenen mesenterialen Fenster mit sterilem Nahtmaterial 7-0. Die Markierungen sollten in dem Fett in der Nähe des Darmes vorgenommen werden. Senden Sie das exteriorisierten Region des Mesenteriums in die Bauchhöhle. Schließen Sie die Bauchmuskeln mit 5-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. Schließen Sie die Haut mit 4-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. Wischen Sie die Fläche mit wechselnden vernäht Tücher über die sterile Gaze in 70% isopropoyl und Jod getränkt. Verbreiten Augensalbe Gel auf beiden Augen der Ratte. Der Zweck der Schmierung des Auges ist, um ein Austrocknen der Hornhaut während des chirurgischen Eingriffs und Wiederherstellung zu verhindern. Die Anwendung von Schmiermittel Auge angewendet werden solltevor Beginn des chirurgischen Eingriffs. Falls nötig, tragen Sie Auge Schmiermittel vor Rückgabe der Ratte in den Käfig für die Verwertung. 3. Tissue Ernte und Fixierung Am Tag der Zinsen nach Stimulation, betäuben und einschläfern die Ratte. In unserem Labor sind Ratten über eine intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,8 mg / kg KG) und dann über intrakardiale Injektion von beuthanasia eingeschläfert betäubt. Beuthanasia ist ein Pentobarbital-Natrium / Phenytoin Lösung, die für eine schnelle und schmerzlos Euthanasie verwendet werden können. Pro Ratte unserem Labor üblicherweise injiziert 0,1 bis 0,2 ml. Öffnen Sie erneut die Bauchhöhle und entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm, und suchen Sie die beiden markierten Fenstern. Schneiden Sie jede der exteriorisierten mesenterialen Fenster mit einer Pinzette und Mikro-Schere. Einschließlich einer Grenze von Fett pro Fenster ist von Vorteil für die spätere Verbreitung Gewebe auf Objektträger. SofortTauchen Sie jedes Fenster in PBS. Beim Schneiden, versuchen zu vermeiden, Durchschneiden der Arterien / Venen-Paare innerhalb des Fett-Grenze der Fenster, um potenzielle Blutfüllung der Fenster zu minimieren. Außerdem minimieren Schneiden durch den Darm führt, dass Darminhalt die Fenster Kontakt. Verwenden einer Pinzette, um Gewebe auf positiv geladene Objektträger ausgebreitet. Zwei Gewebe können pro Folie montiert werden. Lassen Sie das Gewebe teilweise zu trocknen und mit einem Skalpell entfernen Sie das überschüssige Fett. Die Gewebe sind nun bereit, fixiert werden. Typische Befestigungsmethoden verwendet werden. In unserem Labor haben wir häufig zu fixieren Sie die Folien in Methanol (-20 ° C) für 30 min. Erfolgreiche Kennzeichnung hat auch mit nicht fixierten Gewebe durchgeführt. Fixation Methoden könnten auf Ihre bevorzugte Antikörper abhängen. 4. Tissue Immunmarkierung Die Gewebe können in der Regel nun entsprechend den Anweisungen pro Antikörper für die Immunhistochemie gekennzeichnet werden. Da unser Interesse an der Identifizierung der Rollenvaskulärer Perizyten während der Angiogenese, unserem Labor üblicherweise markiert für Endothelzellen und perivaskuläre Zellen 10, 12, 13. Nützliche Markierungen an Endothelzellen entlang der Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken zu identifizieren sind ein anti-PECAM-Antikörper oder BSI-Lektin. Perivaskuläre Zellmarker in diesem Gewebe verwendet werden, umfassen NG2, Desmin, SM-α-Actin, PDFGRβ und Klasse III β-Tubulin. Unten, in Abschnitt 3.3 haben wir Protokolle zur colorimetrischen und fluoreszenten PECAM Immunomarkierung Protokolle aufgelistet. Vor der ersten primären Antikörper Inkubation sind Dias Vakuum getrocknet, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Auch werden die Gewebe zunächst mit einem Wachsschreiber erläutert, um unkontrollierten Antikörperlösungen vom Gewebe zu verhindern. Schließlich werden alle Schritte Kennzeichnung von Wasch-Schritte folgen. Für Waschschritte werden gleitet im Inneren Färbeschalen platziert. Die Pufferlösung wird 3-mal während des Waschvorgangs Dauer ausgetauscht. Endothelzellen Antikörpermarkierung Verfahren: <p class = "jove_step"> PECAM Kolorimetrische Lableing Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. Sekundäre Antikörper-Inkubation: Drip sekundären Antikörper-Lösung (Vectastain Elite ABC-Lösung von Vector Laboratories, ein Streptavidin-Peroxidase sekundären Antikörper-Lösung) auf der Oberseite des Gewebes. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. Inkubieren Gewebe mit Vector Red Nova für 15 Minuten. Dann steigen Gewebe mit Wasser. Berg Dias: Dip Slides in 95% Ethanol 10 mal. Objektträger in 100% Ethanol für 2 Minuten. Objektträger in einem anderen 100% Ethanol sosung für 2 Minuten. Dann Objektträger in aufeinander folgenden 100% Xylol-Lösungen für jeweils 2 Minuten. Trocknen lassen und decken Gewebe mit einer dünnen Schicht aus VectaMount und einem Deckglas. PECAM Fluorescent Labeling Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. Sekundäre Antikörper-Inkubation. Drip sekundären Antikörper-Lösung ((1:100 Streptavidin-CY3 in Antikörper-Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite des Gewebes bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. Berg Dias: Drip 50:50 PBS mit Glycerin auf der Oberseite des Gewebes. Deckenmit Deckglas. Dann verwenden Nagellack, die Lücke zwischen Deckglas und Objektträger zu versiegeln. 5. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder Rattengekröse Gewebe immunhistochemisch für PECAM beschriftet sind in Abbildung 3 dargestellt. PECAM Kennzeichnung identifiziert alle Schiffstypen entlang der Hierarchie der Umbau mikrovaskuläre Netzwerke und können verwendet werden, um angiogenen Metriken zu bestimmten Zeitpunkten nach Stimulation zu quantifizieren. PECAM Kennzeichnung ermöglicht auch die Bestimmung von Arteriolen gegenüber Venolen. Zuführen Arteriolen typischerweise kleinere Durchmesser und länglichen Endothelzell-Morphologie im Vergleich zu paarenden Venolen (Abbildung 4). Kapillaren und Kapillare Sprossen können auf Basis ihrer Gefäßdurchmesser und die relative Position in einem Netzwerk identifiziert werden. Typische Merkmale der Umbau Netzwerke sind eine erhöhte Kapillar sprießen, Gefäßdichte, vaskularisierten Bereich und venulären tortuosITY. Quantifizierung verschiedener Metriken angiogenen identifiziert den zeitlichen Verlauf der das Wachstum des Netzwerks (5). Kapillar sprießen aus bereits bestehenden Gefäßen, Spitzen zwischen Tag 3 und Tag 5 und kehrt in den unstimulierten Niveau von Tag 10. Diese vorübergehenden Anstieg der Keimung wird durch Erhöhung der Gefäßdichte und vaskularisierten Bereich folgten. Als Beweis für die Neugestaltung von größeren Schiffen in diesem Modell ist die Zahl der Arteriolen und Venen Segmenten erhöht sich auch über den Zeitverlauf. In unserem Labor ist dieses Modell verwendet, um zelluläre phänotypische Veränderungen bei bestimmten Zeitpunkt während dieser Umbauprozess 10, 11 zu identifizieren. Zum Beispiel identifiziert Klasse III β-Tubulin-Perizyten entlang angiogenetischen Gefäßen (Abbildung 6). In nicht stimulierten Geweben, ist der Klasse III β-Tubulin-Expression spezifischer Nerven. Im Gegensatz dazu auf dem Höhepunkt der Kapillare sprießen, wird der Klasse III β-Tubulin durch perivaskuläre Zellen exprimiert. Diese Artvon Ergebnis unterstreicht die Verwendung dieser einfachen und robusten angiogenen Modell, um neue Zelltypen im angiogenen Prozess beteiligt sind. Abbildung 1. Bilder des Kunststoff-Bühne Pre-und Post-Modifikation. Die zuvor modifizierten Stufe ist ein 100 mm Petrischale. Modifikationen umfassen einen elliptischen Schnitt Loch in der Mitte und die anschließende Zugabe von Knetmasse oder Silikonkleber auf das Loch der Rand für die Schaffung einer erhöhten, glatte Oberfläche. Diese Oberfläche bietet eine innere Grenze, die Superfusion der exteriorisierten mesenterialen Fenstern erleichtert. Maßstabsbalken ist 1 cm. Abbildung 2. Das Bild von exteriorisierten mesenterialen Region. Mesenteriale Fenster sind wie die dünne lichtdurchlässige Membranen zwischen den Arterien / Venen-Paare Fütterung der Dünndarm definiert. Während der ExteriorisationDauer ist die mesenterialen Bereich angelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht in einem modifizierten Petrischale. Inerten gelben Modelliermasse bietet eine glatte Oberfläche für das Mesenterium, um durch die vorgestanzten Löcher gezogen werden. Maßstabsbalken ist 1 cm. Abbildung 3. Repräsentative Bilder mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10 Tage nach der Entäußerung des Mesenteriums. PECAM Kennzeichnung identifiziert die Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich, Arteriolen (A), Venolen (V) und Kapillaren (C). Beitrag Stimulation, erscheint mikrovaskulären Netzwerken eine Zunahme der Kapillare sprießen (Pfeilspitzen) und Gefäßdichte. Maßstabsbalken ist 100 um. Abbildung 4. Repräsentative Bilder Arteriole / Venole Paare innerhalb erwachsenen Ratte mesenterialen mikrovaskulären Netzwerks. In beiden Abbildungen können Arteriolen (A) von Venolen (V) basierend auf einem kleineren Durchmesser und relativ länglichen Endothelzell-Morphologie unterschieden werden. Scale-Bars sind 20 um. Abbildung 5. Vertreter Quantifizierung der Angiogenese-Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Wachstum Beitrag Mesenterium Exteriorisation. A) Vascular Fläche pro Gewebebereich. B) Zahl der kapillaren Sprossen pro vaskulären Bereich. C) Gesamt vaskulären Länge pro vaskulären Bereich. * Steht für signifikanten Unterschied im Vergleich zu nicht stimulierten Gruppe. Statistische Vergleiche wurden mit einem One-Way ANOVA durch Dunn-Test gefolgt. (P <0,05). UN stellt unstimulierten. Abbildung 6. Vertreter fluoreszierende Bilder von mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10Tag posten Exteriorisation des Mesenteriums. Immunfluoreszenz PECAM Kennzeichnung (rot) identifiziert Endothelzellen und Klasse III β-Tubulin-Kennzeichnung (grün) identifiziert Nerven (Pfeilspitzen) und perivaskulären Zellen (Pfeile). Perivaskulären Zellen transient hochreguliert Klasse III β-Tubulin während Kapillare sprießen. In unstimulierten mikrovaskulären Netzwerken ist Klasse III β-Tubulin-spezifischen Nerv und keine perivaskulären Zellen zu identifizieren. 3 Tage nach der Stimulation, Klasse III β-Tubulin-positiv markiert perivaskulären Zellen entlang Mikrogefäße. Am Tag 10, beginnt der Klasse III β-Tubulin-Expression auf den unstimulierten Szenario zurückkehren. Scale-Bar ist 50 um. Abbildung 7. Bilder unterstützen die Machbarkeit der Tracking voretikettiert lokal applizierten Zellen während der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum durch das Mesenterium Exteriorisation stimuliert. Die Zellen wurden über Mesenter superfundiertIC-Fenster während des 20-minütigen Zeitraum Exteriorisation. 1 Tag nach der Operation, DiI-markierten Zellen (rot) in der Brennebene Dame mit PECAM positiven Mikrogefäße (grün) beobachtet. A, B) Beispiele für DiI markiertem Knochenmarkszellen aufweist gerundet und Morphologien verlängert. In einigen Fällen (Pfeile)-Zellen wurden zusammen Mikrogefäße verlängert. C) Beispiel eines Clusters von DiI markiertem mesenchymalen Stammzellen in der Nähe der Spitze einer Kapillare sprießen (Pfeil). Scale-Bars sind 50 um (A), und 20 um (B, C).