NADPH氧化酶在巨噬细胞的活性氧(ROS)的主要来源。由于ROS的短暂性的,它是难以衡量和监测中生活的动物的细胞内ROS水平。 ROS在活小鼠的串行量化的一种微创的方法。
NADPH氧化酶是一种关键的酶介导的抗菌和抗真菌的宿主防御。 NADPH氧化酶除了其抗菌宿主防御中的作用,具有关键的信令功能,调节炎症反应1。因此,发展的方法来衡量“实时”的动力学NADPH氧化酶衍生的活性氧的产生是一个有价值的研究工具,了解相关的宿主防御,炎症和损伤的机制。
慢性肉芽肿病(CGD)是一种遗传性疾病的特点是严重感染和过度炎症反应的NADPH氧化酶。吞噬细胞的NADPH氧化酶的激活需要易位其胞浆亚基(PHOX,P67 PHOX的p47和p40的PHOX)和Rac的膜- ,绑定flavocytochrome(由一个gp91 phox和22页PHOX异二聚体)。损失在任何这些NADPH氧化酶成分结果在CGD的功能的突变。相似患者CGD,gp91 PHOX-缺陷小鼠和的p47 PHOX-缺陷小鼠有缺陷的吞噬细胞的NADPH氧化酶的活性和受损的宿主防御13,14。除了的吞噬细胞,其中含有上述成分的NADPH氧化酶,各种其他类型的细胞表达的NADPH氧化酶的不同的亚型。
在这里,我们描述了一种方法来量化ROS生产的活老鼠,并划定的贡献,NADPH氧化酶的活性氧的产生的炎症和损伤模型中的。这种方法是基于对ROS与L-012(鲁米诺类似物)反应,以发射由一个电荷耦合器件(CCD),被记录的发光。在原始描述的L-012探针,L-012-依赖化学发光完全废除了超氧化物歧化酶,表明在该反应中检测到的主要活性氧是超级超氧阴离子15。随后的研究表明,L-012,可以检测到的其他自由基,包括活性氮物种16,17。 kielland等17表明,局部应用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯,一种强力的NADPH氧化酶的活化剂,导致NADPH氧化酶-依赖性ROS生成使用发光探头L-012的小鼠中可检测到的。在这个模型中,他们表明:,P47 PHOX缺失的小鼠L-012-依赖的发光被取消。
我们比较了野生型小鼠和NADPH氧化酶缺乏P47 PHOX-/ –小鼠在以下三种模式:1)气管内给药的酵母,真菌细胞的促炎症墙衍生产品,可以激活NADPH氧化酶的活性氧的产生; 2)盲肠结扎穿刺(CLP),继发性急性肺部炎症和损伤腹内脓毒症模型; 3)口服四氯化碳(CCL),ROS依赖的肝损伤模型。这些模型是专门选定在非感染性炎症,多菌性败血症,毒素诱导的脏器损伤的情况下,分别评估NADPH氧化酶 – 依赖性ROS生成。在野生型小鼠比较,生物发光P47 PHOX-/ –小鼠,使我们能够描出P47 PHOX含NADPH氧化酶的生物发光信号在这些模型中所产生的ROS的具体贡献。
生物发光成像的结果表明增加细胞内ROS水平在野生型小鼠相比,P47 PHOX-/ –小鼠NADPH氧化酶产生的ROS的主要来源是炎症刺激。这种方法提供了一种微创的方法为“实时”监控产生的ROS在体内的炎症。
“实时”测量的活性氧(ROS)可以通过使用荧光和化学发光探针在生活的动物。虽然荧光探针患有具有弱的信号-噪声比12,成像技术描述的是更敏感的检测发光基于鲁米诺-底物L-012的化学反应的活性氧。像所有的生物发光的成像技术,这种方法是有限的器官和组织的依赖于波长的光的吸收和散射。这些实验都集中在建立适当的测量ROS在野生型P47 PHOX-/ –小鼠的…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由NIH RO1 AI079253和退伍军人事务部。