ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

1. הכנת המנה הכלים המשמשים תרבות פרוסת הם תחתית זכוכית (עם coverslip כבסיס) (מנות WillCo). אלו ממוקמות על רקמת העדשה מנה 6 ס"מ רקמת התרבות לשמור על התחתונה זכוכית נקייה. ביום שלפני הניסוי, הוסף 2 מ"ל 0.1% פולי-L-ליזין פתרון צלחת זכוכית דגירה תחתית ועל 5min בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את פולי-L-ליזין לצפות את תחתית הכוס. הסרה של פולי-L-ליזין פתרון ולשטוף שלוש פעמים במים deionised ולאחר מכן פעם אתנול 70%. להשאיר לייבוש למשך הלילה. המנות ניתן גם לייבש בעדינות על ידי חימום במיקרוגל על ​​צריכת חשמל נמוכה של 30-45 שניות. 2. העובר electroporation דגירה ביצים על 37 ° C עד המבורגר, המילטון (HH) שלב 10 (~~~HEAD=NNS 36 שעות) (או בשלב אחר הרצוי). לפני שמתחילים להכין מחטים זכוכית (אנו משתמשים לוהטים / דגם בראון p87 חולץ microcapillary) ולשבור את קצה needlדואר באמצעות מלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ לנתח. בסופו של המחט צריך להיות חד מספיק כדי לחדור את העובר בזמן לא להיות צר כך שהוא מעכב הזרקה של פתרון ה-DNA. חלון ביצים אלקטרודות במקום (5 מ"מ זה מזה) בכל צד של העובר להזריק DNA (~ 0.025-0.5 מיקרוגרם / μl במים deionised בצבע עם כמות קטנה של ירוק מהיר) לתוך הצינור העצבי. החל הנוכחי – 12-17 V 3 פעמים, אורך הפולס 50ms עם 950 מילישניות בין הפולסים. אנו משתמשים בריכוזים נמוכים של ה-DNA ומתחים electroporation נמוכים כדי להשיג ביטוי פסיפס, כדי שנוכל לעקוב אחר תאים בודדים. לכסות את חלון קליפת הביצה עם cellotape ולוודא שהוא חתום. אפשר לשחזר עוברים על 3-4 שעות או לילה בשעה 37 ° C. 3. קולגן והתרבות Slice הכנה בינונית להכין תערובת קולגן תרבות בינונית פרוסה כשעה לפני חיתוך. ל -300 לא μlype 1 קולגן להוסיף 100 הפתרון μl 0.1% חומצה אצטית ו – 100 μl 5 x L15 בינוני. מערבולת היטב לאחר כל הוספה. הפתרון צריך להפוך צהוב. עכשיו להוסיף 15-20 נתרן ביקרבונט μl 7.5% ו מערבולת ביסודיות. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת, את עוצמת הקול של סודיום ביקרבונט נדרש לכך עשויים להיות שונים. שמור על הקרח ולעשות את טרי בכל פעם. בינוני עד 10 מ"ל neurobasal להוסיף תוסף B-27 ו Glutamax, לריכוז x 1 סופי 10 הפתרון גנטמיצין μl. בינוני מקום 37 ° C חממה שנאגרו עם 5% CO 2. להשאיר את החלק העליון של המיכל רופף כדי לאפשר לו לאזן עם 2 CO. 4. פרוסת תרבות הסר עוברים מן הביצה ולשטוף במדיום L15. מקום בצלחת רקמת התרבות בשכבת sylgard בחלק התחתון ולהדק אותם דרך חוץ עובריים ממברנות סביב כך הם מתוחים. באמצעות מיקרופוןroknife, העובר פרוסת וישרים ככל האפשר דרך האזור של עניין. על חוט השדרה, פרוסות צריך להיות בין 1-2 somites עבים. להשאיר פרוסות המחוברות העובר בזמן שאתה חותך עוברים אחרים כדי שלא לאבד אותם. הכן טיפ 200 micropipette μl ידי ניתוק ~ 1 מ"מ של קצה ו מצרף את זה P2 או P10. הטיפ הזה ישמש כדי להעביר את הפרוסות לצלחת בעמוד השדרה התחתון זכוכית. טיפ 10 μl אינה רחבה מספיק כדי להרים את פרוסות. המעיל הפנימי של קצה עם קולגן על ידי pipetting 1 תמהיל קולגן μl הכין קודם לכן. להשאיר למשך 1-2 דקות ולאחר מכן לשטוף עם המדיום L15. זה ימנע את הרקמה להידבק לחלק הפנימי של קצה. ניתוק פרוסת מעובר באמצעות microknife ולהסיר צלחת באמצעות P2 או P10 מצויד טיפ 200 μl ומוגדרת μl 1. נסו לקחת את כמדיום שפחות. תערובת קולגן ירידה וורטקס 5-8 μl של זה על צלחת פולי-L-ליזין מצופה. Immediaלשים פרוסת tely העובר לתוך קולגן העמדה למקום עם זוג מלקחיים עדינים. פרוסות יש למקם כך את הצד להיות צילמו הוא מיושר עם coverslip. רקמת צריך לדבוק ציפוי פולי-L-ליזין על coverslip. חזור על פעולה זו עד שיהיו לך כמה פרוסות על coverslip. בדרך כלל אנחנו יכולים למקם 6-9 פרוסות על צלחת אחת. ברגע שכל הפרוסות נמצאים במקום, מכסים את הצלחת ולאפשר קולגן להגדיר במשך 20 דקות. כמה קולגן להציב המוקדם ייתכן שכבר החלו להתייבש. כדי למנוע זאת להוסיף כמות קטנה של L15 אלה לפני כיסוי. לאחר ההגדרה, בזהירות להוסיף פרוסת 2ml התרבות בינוני כי כבר equilibrated ב CO 5% 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות. יש להקפיד שלא לעקור את הקולגן coverslip. מקום 37 ° / 5% 2 CO החממה ולאפשר פרוסות לשחזר לפחות 3 שעות לפני הדמיה. אם אין, לחות במקום צלחת של שנינות תיבת פרספקסקצת חה של נייר לח בפינה אחת. 5. עובריים הדמיה Slices אנו עושים שימוש רחב בתחום Core DeltaVision מיקרוסקופ מצויד בתא WeatherStation הסביבה פרוסות תמונה. החדר נשמר כל הזמן עם מנגנון 2 CO זלוף על 37 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על הבמה מיקרוסקופ על 5% CO 2 / אוויר 95%. ההדמיה מתבצעת בדרך כלל תוך שימוש 40 x / 1.30 טבילה NA העדשה נפט תמונות שנתפסו עם HQ2 CoolSnap מקורר מצלמת CCD. Z-קטעים נלכדים כל 1.5 מיקרומטר דרך רקמות 45 מיקרומטר. זמן חשיפה יש לשמור נמוך ככל האפשר. בדרך כלל אנחנו לחשוף עבור 5-50 MS-Z עבור סעיף זה. תמונות נלכדים כל 7 דקות, עד 9 פרוסות וניתן לבקר בו באמצעות נקודה מדויקת של מערכת DeltaVision ביקור לתפקד. 6. נציג תוצאות זמן לשגות למשל רצף של תאים בעמוד השדרה אבי הואבאיור. 2 א 'ו – סרט המתאים 1. הדמיה החלה על פרוסת חוט השדרה של העובר (בשלב HH 12) יומיים בת. תא זה transfected עם מבנה ה-GFP-להביע αTubulin. בשלב מוקדם זה, ובתאים עצביים עוברים בעיקר אבי, אב חטיבות מצב שבו התאים מתחלקים על מנת ליצור שני תאים נוספים אב אופניים. איור. סרט 2b ו המקביל 2 מראה תא transfected עם GFP-GPI (GPI מעוגנת GFP), המציין את קרום התא. תא זה עובר חלוקה שבהן התהליך הבסיסי מתפצל לשניים בירושה שווה בשווה על ידי לתאי הבת. באיור 1. תרבות Slice פרוטוקול הדמיה זמן לשגות. איור 2. תא Behavior במהלך התפתחות תקינה חוט השדרה. (א) מסגרות נבחרים מהסרט 1. תא להביע GFP-טובולין מחלק עם מטוס מחשוף כי היא בניצב למשטח הפסגה (2 שעות 20 דקות), יצירת שני תאים המתחלקים הבת שוב (24 שעות 23 דקות ו 25 שעות 54 דקות). (ב) מסגרות נבחרים מהסרט 2. תא transfected עם GFP-GPI עובר חלוקת התא שבו התהליך הבסיסי הוא מפוצל (חיצים לבנים) ו ירש באותה מידה על ידי לתאי הבת. סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט . סרט 2. לחץ כאן לצפייה בסרט .