Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)
Summary
Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.
Abstract
Lange-kodierende RNAs sind wichtige Regulatoren der Chromatin Staaten für wichtige biologische Prozesse wie Dosiskompensation, Imprinting und Entwicklungsstörungen Genexpression 1,2,3,4,5,6,7. Die jüngste Entdeckung von Tausenden von lncRNAs in Verbindung mit spezifischen Modifikation Chromatin-Komplexe wie Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) vermittelt, dass Histon H3 Lysin 27 Trimethylierung (H3K27me3), breite Rollen für zahlreiche lncRNAs bei der Verwaltung von Chromatin-Staaten in einer Gen-spezifischen schlägt Mode 8,9. Während einige lncRNAs gedacht werden, um in cis auf benachbarte Gene arbeiten, arbeiten andere lncRNAs in trans zu weit entfernten Gene regulieren. Zum Beispiel sind Drosophila lncRNAs roX1 und roX2 bind zahlreichen Regionen auf dem X-Chromosom der männlichen Zellen, und entscheidend für Dosiskompensation 10,11. Allerdings sind die genauen Standorte von ihren Bindungsstellen nicht mit hoher Auflösung bekannt. In ähnlicher Weise können menschliche lncRNA HOTAIR PRC2 Belegung auf h beeinflussenundreds von Genen genomweiten 3,12,13, aber wie Spezifität erreicht wird, ist unklar. LncRNAs kann auch als Modulgerüsten dienen dazu, die Montage von mehreren Protein-Komplexe zu rekrutieren. Die klassische trans-agierende RNA-Gerüst ist die TERC RNA, die als Vorlage und Gerüst für die Telomerase-Komplex 14 dient; HOTAIR kann auch als Gerüst für PRC2 und einem H3K4 Demethylase Komplex 13 zu dienen.
Frühere Studien Mapping RNA-Belegung am Chromatin haben gezeigt, wesentliche Einblicke 15,16, aber nur an einem einzigen Gen-Locus zu einer Zeit. Die Belegung der meisten Websites lncRNAs sind nicht bekannt, und die Rollen von lncRNAs in Chromatin Regulation wurden zumeist aus den indirekten Auswirkungen der lncRNA Störung abgeleitet. So wie Chromatin-Immunopräzipitation von Microarray-oder tief-Sequenzierung (ChIP-Chip oder Chip-seq bezeichnet) verfolgt hat, unser Verständnis von Protein-DNA-Wechselwirkungen im genomischen Maßstab verbessert, hier haben wir veranschaulichen eine recenTLY veröffentlichten Strategie zu lange RNA-Belegung genomweiten bei hoher Auflösung 17 Karte. Chromatin-Komplex, der durch Antisense-Oligonukleotide Tiling, der dann eine Karte der genomischen Bindestellen bei einer Auflösung von mehreren hundert Basen mit: Diese Methode, Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp) (Abbildung 1), basiert auf Affinität Erfassung von Soll-lncRNA Basis hoher Empfindlichkeit und geringem Hintergrund. Chirp ist auf viele lncRNAs, weil das Design der Affinitäts-Sonden ist einfach aufgrund der RNA-Sequenz und erfordert keine Kenntnis der RNA-Struktur oder funktionelle Domänen.
Protocol
Discussion
Hier beschrieben CHIRP-seq, ein Verfahren zur Zuordnung in vivo lncRNA Bindungsstellen genomweiten. Die wesentlichen Parameter für Erfolg sind die Split-Pools von Fliesen Oligonukleotid-Sonden und Glutaraldehyd-Vernetzung. Das Design der Sonden-Affinität ist einfach angesichts der RNA-Sequenz und erfordert keine Vorkenntnisse in der RNA-Struktur oder funktionellen Domänen. Unser Erfolg mit roX2, TERC und HOTAIR – drei ziemlich unterschiedlichen RNAs in zwei Arten – legt nahe, dass CHIRP-seq wahrscheinlich verallgemeinerbar zu viele lncRNAs ist. Wie bei allen Experimenten werden Pflege und angemessene Kontrollen erforderlich, um die Ergebnisse zu interpretieren. Verschiedene lncRNA kann Titration von Bedingungen, und vernünftige Änderung der Bedingungen, wie zB Auswahl von verschiedenen Affinitätssonden oder Vernetzer erfordern, kann auf unterschiedliche Aspekte der RNA-Chromatin-Wechselwirkungen. Wie Chip-seq sind nicht alle Bindungsereignisse unbedingt funktional, und weitere Studien sind erforderlich, um die biologischen Folgen der RNA-o ermittelnccupancy auf Chromatin. Dennoch sehen wir viele interessante Anwendungen dieser Technologie für Forscher anderer Chromatin-assoziierten lncRNAs, die jetzt in die Tausende 8,9. So wie ChIP-seq hat die Tür für genomweite Untersuchungen der DNA-Protein-Interaktionen eröffnet, kann CHIRP-seq Studien des "RNA Interaktom" enthüllen viele neue Wege der Biologie.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, und I. Shestopalov für Diskussionen. Unterstützt von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur (CC), NIH R01-R01-und CA118750 HG004361 (HYC) und California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC ist ein Early Career Wissenschaftler des Howard Hughes Medical Institute.
Materials
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
| Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
| Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
| PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
| Superase-in | Ambion | AM2696 |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
| Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
| C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
| PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
| DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
| MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
| Rnase H | Epicentre | R0601K |
| Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
| Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
| Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
| Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
| Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
| Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
| 10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
| DNA-free | Ambion | AM1906 |
| Buffer kit | Ambion | AM9010 |
| Formamide | Invitrogen | 15515-026 |
Referências
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