Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием "Единое геномики Вирус"
Summary
Одноместный геномики Вирус (SVG) является методом, чтобы изолировать и усилить геномы одного вирионов. Вирусные суспензий смешанной сборкой сортируются с использованием проточной цитометрии на предметное стекло микроскопа с дискретными лунки, содержащие агарозы, тем самым захватив вириона и сокращение генома сдвига во время последующей обработки. Амплификация полного генома достигается использованием нескольких усиления смещения (MDA), в результате геномный материал, который подходит для секвенирования.
Abstract
Амплификация полного генома и секвенирование одного микробных клеток позволяет геномной характеристики без необходимости выращивания 1-3. Вирусы, которые повсеместно и самыми многочисленными лицами на нашей планете 4 и важным во всех средах 5, до сих пор не показал через аналогичные подходы. Здесь мы опишем подход для выделения и характеризующие геномы одного вирионов называется "Единое геномики Вирус" (SVG). SVG использует проточной цитометрии выделить индивидуальные вирусы и весь амплификации генома для получения высокого молекулярного веса геномной ДНК (гДНК), который может быть использован в последующих реакциях секвенирования.
Protocol
Discussion
Ряд важных факторов, должны быть приняты во внимание при применении SVG подходов. Генотипирования, как мы делали во время проверка концепции эксперимента 13, не является допустимым вариантом для экологического или неизвестных изолятов консервативных праймеров не доступны во всех …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Кена Nealson за его понимание и консультации на протяжении всего процесса подготовки рукописи.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referências
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
