Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit 'Single Virus Genomics'
Summary
Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung geeignete ist.
Abstract
Amplifikation des gesamten Genoms und Aneinanderreihung einzelner mikrobiellen Zellen ermöglicht Genoms ohne die Notwendigkeit des Anbaus 1-3. Viren, die allgegenwärtig und die meisten zahlreiche Unternehmen auf unserem Planeten 4 und wichtig in allen Umgebungen 5 sind, müssen noch über ähnliche Ansätze aufgedeckt werden. Hier beschreiben wir einen Ansatz für die Isolierung und Charakterisierung der Genome einzelner Virionen genannt 'Single Virus Genomics "(SVG). SVG verwendet Durchflusszytometrie einzelnen Viren, Amplifikation des gesamten Genoms zu isolieren, um hochmolekulare genomische DNA (gDNA), die in nachfolgenden Reaktionen Sequenzierung verwendet werden können erhalten.
Protocol
Discussion
Eine Vielzahl wichtiger Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn die Anwendung SVG Ansätze. Genotypisierung, so wurde während des Proof-of-Concept-Experiment 13 durchgeführt wird, ist keine gültige Option für die Umwelt oder die unbekannten Isolate als konservierte Primer nicht verfügbar sind, in allen viralen Gruppen. Auch ist Hintergrund DNA-Synthese oder unspezifische Amplifikation häufig während der Amplifikation mit dem MDA-Reaktion 14 gemeldet. Die unspezifische Amplifikation kon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Ken Nealson für seine Einsicht und Beratung während des Manuskripts Prozess danken.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referências
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