Experimentele Procedure: 1. Transfectie met Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit Wij beschrijven hier de transfectie van een naïeve of in vitro geactiveerde primaire T cellen met expressie-plasmiden die coderen signaalmoleculen gecodeerd door GFP met de Amaxa muis T-cellen Nucleofector Kit. In-vitro activatie van T cellen met peptide geladen milt APCs wordt uitgevoerd zoals beschreven 7. Alle T-cellen die in ons onderzoek komen voor rekening en TCR, dat MCC peptide (88-103) gebonden aan het MHC-molecuul dus brei herkent. Transfectie wordt uitgevoerd in hoofdzaak volgens de aanbevelingen van de fabrikant, echter we enkele uiteinden die levensvatbaarheid van de T-cellen na transfectie bevorderen. Zowel levensvatbaarheid en transfectie-efficiëntie veel hoger in vitro geactiveerde T-cellen dan in naïve cellen. Voordat u begint, voor te bereiden 2 mL aangevuld T-cel-medium door toevoeging van 20 ulbeide medium componenten A en B en 100 pi foetaal runderserum (5%) voor elke transfectie wordt uitgevoerd. Evenwicht het medium in een 12-wells plaat in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende minstens een uur. Ook aliquots medium aangevuld met 5% serum en komponent A kan worden bereid en ingevroren. Indien dit het geval is, ontdooien het vereiste aantal porties toevoegen Component B en voer de equilibrering. – Pre-evenwicht van het medium is zeer belangrijk, omdat celdood zal uit het resuspenderen van cellen na transfectie in medium dat koud of een pH dan 7,2. Vervolgens de voorbereiding van de transfectie mengsel. Combineer 82 pl van Mouse T Cell Nucleofector oplossing met 18 ul van het Supplement 2 en 5μg van plasmide DNA (concentratie niet lager dan 0,5 pg / pl). Meng goed door te tikken op de buis of met het gebruik van micro-pipet. -Het is belangrijk te voeren een titratie van plasmide dosis voor een bepaald aantal cellen voor elk construct worden gebruikt voor transfectie. Bij wat grotere constructen kunnen meer DNA nodig. DNA dient vrij van endotoxine. Breng 5 tot 10 miljoen cellen 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 600 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder zo veel van de bovenstaande mogelijk met een vacuüm aspirator. – De fabrikanten raden het draaien van de cellen op minder dan 90x g, in ons geval, deze snelheid komt overeen met 75x g. De gekozen relatieve centrifugale kracht (RCF) om een cel te krijgen pellet is misschien wel de meest cruciale variabele, zoals centrifugering bij lage RCF zich verzet tegen beschadiging van de celmembraan. Resuspendeer de celpellet in de transfectie mengsel door voorzichtig en langzaam pipetteren de celpellet totdat er geen grote brokken van de cellen die overblijven. Dit kan doorgaans worden bereikt door het volledig opzuigen de cellen through de pipetpunt niet meer dan 3-4 keer. Met behulp van een pipet voorzichtig breng de inhoud in een gecertificeerde Amaxa kuvet, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Cap de cuvette. Kies Nucleofector programma X-001 op het Nucleofector apparaat. Plaats de cuvet in de Nucleofector cuvettehouder en breng het geselecteerde programma. – Na electroporating de cellen, het beste direct overbrengen naar de vooraf geëquilibreerd kweekmedium. De fabrikanten bevelen aan dat de cellen worden bewaard in de nucleofector medium voor niet langer dan 15 minuten. Breng de cuvet en de pre-evenwicht, volledig aangevuld kweekmedium aan de kap. Met behulp van de meegeleverde plastic pipet wordt ongeveer 500 pl van het medium om de cuvette en breng de celsuspensie aan het medium in de plaat druppel voor druppel. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 4 uur voor beeldvorming. Naïve cellen zijn incubated bij 30 ° C in plaats van 37 ° C. Hierdoor worden de reactiviteit aan antigeen. – Drie tot vier uur incubatie algemeen voldoende om T-cellen detecteerbaar drukken de GFP gemerkte eiwitten. We hebben gekozen om de afbeelding cellen op dit moment punt, omdat het niveau van expressie is laag en artefacten van de over-expressie dient te worden geminimaliseerd. Als over-expressie van een specifiek eiwit gewenst dienen echter T-cellen worden verwijderd uit de Amaxa medium na 4 uren. Dit wordt bereikt door opnieuw pelletting de cellen bij lage RCF en resuspenderen in vooraf geëquilibreerd T cel kweekmedium aangevuld met 50 U / ml interleukine 2 (IL-2) bij een dichtheid van 2 miljoen cellen / ml. 2. TIRF Microscopie Beschrijving van de TIRF microscoop: Algemeen configuratie: optische componenten werden rond een Olympus IX71 fluorescentiemicroscoop die oorspronkelijk was uitgerust met een Olympus TIRF module. Al snel discovered chromatische effecten in deze module als een enkele lijn staat er niet in geslaagd samenvalt collimatie voor laser-lijnen van verschillende golflengtes. Deze module zou dus niet mogelijk voor gelijktijdige TIRF beeldvorming met behulp van verschillende golflengten, en we begonnen om een aangepaste TIRF apparaat dat chromatische effecten minimaliseert in het systeem, zoals we in detail te bespreken in de volgende secties te bouwen. De hier beschreven methode is ontwikkeld voor de 150 X vergroting, 1,45 numerieke apertuur (NA) TIRFM doelstelling (Olympus), maar werkt net zo goed voor de 60 X vergroting, 1,45 NA versies. Voor brede-belichting wordt de microscoop verbonden met een metaalhalogenide Lambda-XL lichtbron en een excitatiefilter wiel (Sutter Instruments) voorzien excitatie filters. Voor automatische positionering van de monstertafel met betrekking tot het doel is de microscoop voorzien van een gemotoriseerde XY vertaling piëzo-gecontroleerde Z fase (ASI). Beelden worden vastgelegd met behulp van twee identieke QuAntem elektron vermenigvuldiging (EM) CCD-camera's (Photometrics). De pixelgrootte van deze camera's past heel goed met de vergroting aangeboden door de 150 X TIRF doelstelling, het geven van een definitieve oplossing van 0,1 micrometer per pixel. De EMCCD camera's bieden ook de gevoeligheid voor GFP transfectanten met lage expressieniveau te visualiseren. Lasers: Voor TIRF verlichting een systeem van 5 lasers leveren een totaal van 6 lijnen laser (405, 440, 488, 514, 561 en 640 nm) is gekoppeld een single-mode vezel (Solamere Technologies). De laser Argon en 561 nm diodegepompte vaste toestand (DPSS) laser (lijnen 488, 514 en 561) lopen via een acousto-optische vezel regelbare (AOTF) voor de intensiteit controle, terwijl de intensiteit van de diodelasers (405, 440 en 640 nm) wordt geregeld door regeling van de spanning van de voedingen. De spanning op de AOTF en de voedingen van de diode lasers wordt gecontroleerd door middel van een data-acquisitie kaart (DAC) boord (Measurement Computing) met behulp van Metamorph software (moleculaireLAR Devices). De koppeling efficiëntie voor de diodelasers 30% en die van de Argon en DPSS lasers ongeveer 60% door hun kleinere straal diameters. TIRF module: Om tegelijkertijd het imago van de TCR en de bijbehorende signaalmoleculen, zoals eerder beschreven, was het essentieel om TIRF verlichting die chromatisch is bijgesteld en dat zou niet nodig aanpassing of heroriëntatie bij de aanschaf van fluorescentie-uitstoot van verschillende golflengten hebben. TIRFM werd bereikt met het tijdens de belichting doel, zoals eerder beschreven 17. De glasvezelkabel dat laserlicht levert aan de microscoop werd vastgezet in een vezel lancering voorzien van een XY-vezelhouder gemonteerd bovenop een micrometer-driven optische rail voor Z-aanpassing (Thorlabs). Om TIRF verlichting te bereiken wordt de laserbundel gericht op de achterkant brandvlak van het doel met een systeem van twee lenzen (L1 (Collimatorlens) en L2 (focusseerlens) in figuur 1), zodat de bEAM voorschijn gecollimeerd uit van de doelstelling. Dit verzekert dat alle lichtstralen die uit de doelstelling dezelfde hoek ten opzichte van het monster vlak. Het uiteinde van de optische vezel wordt geplaatst in het brandpunt van de collimerende lens. Door de micrometer langs de optische rail ten opzichte van de Collimatorlens (de Z-richting) is het mogelijk om de aandacht van de bundel te passen en de balk bewegen X en Y XY verstelknoppen. Door het zeer geringe achterzijde apertuur van het objectief 150 X, bleek dat op TIRF de omvang van de laserspot op de achterkant brandvlak nodig klein bereiken. Om de aandacht nodig om de kleine spot produceren bereiken lenzen korte brandpuntsafstand nodig waren (Keir Neumann, persoonlijke communicatie), dus gebruik gemaakt van een focusseerlens met een brandpuntsafstand van ongeveer 108 mm, dat is geplaatst in de dichroïsche kubus direct voorafgaande de doelstelling. De optieksysteem werd dichter bij de beam splitter die welke in de TI geplaatstRF-verlichting. Om ongewenste effecten te minimaliseren chromatische, gebruikten we achromatische wambuizen (chromatisch gecorrigeerd lens gemaakt door het fuseren van twee lenselementen gemaakt van materialen met verschillende brekingsindex) met anti-reflectie coatings voor zowel de collimeren en zich te concentreren lenzen (JML Optical). De aandacht kan worden geverifieerd dat de balk voorschijn gecollimeerd van het doel bij in het midden van de opening en achter moet een strakke trefvlek op het plafond. De positie van de gefocusseerde vlek wordt verplaatst naar de rand van de opening (in de Y-richting) waardoor de bundel te convergeren op het beeldvlak onder grote hoeken, en uiteindelijk de kritische hoek van totale interne reflectie wordt verkregen. Met behulp van deze optische componenten, behaalden we gelijktijdig collimatie voor alle golflengten 442 tot 640 nm op dezelfde lijn. Een optische uitlijning derhalve konden we tegelijkertijd uit TIRFM meerdere golflengten. Dual Camera ApparATUS: Gelijktijdige verkrijging van afzonderlijke fluorescentie-emissie als gevolg van twee fluoroforen werd verwezenlijkt door een dubbele camerasysteem de emissie splitst in twee golflengtegebieden door middel van dichroitische spiegels (figuur 2). Uitgestraalde licht wordt weerkaatst door de doelstelling uit de rechterkant poort van de microscoop. Aangezien de meeste doelstellingen oneindig gecorrigeerd (met beelden gevormd oneindig) een buis lens nodig om het beeld scherp. Gelijktijdig manipuleren twee emissiegolflengte werd de buis lens rechts poort verwijderd. Een aangepaste adapter met C-mount draden (Sutter Instruments) werd bevestigd en gekoppeld aan een dichroïsche spiegel houder (Edmund Optics). Dichroitische spiegels de GFP emissie scheiden van die van organische kleurstoffen de TCR (Alexa546, Alexa647, enz.) te labelen werden in deze houder. Deze module werd in beide lichtwegen door een buis lenshouder een emissie filterhouder verlengbuizen. Debuis lenzen (TL1 en TL2 (figuur 2)) heeft een brandpuntsafstand van 180 mm. Gaten in de zuigbuizen leidt tot EM CCD-camera bedekt met zwart papier de camera beschermen tegen strooilicht. Om voor het uitlijnen van de twee kanalen, werden de camera's gemonteerd op twee custom XYZ vertaling staat (Holmarc Producten). Hieronder beschrijven we hoe u de microscoop voor twee kanalen gelijktijdig beeldvorming uit te lijnen. De betrokken maatregelen zijn het uitlijnen van de TIRF verlichting, het aanpassen van de laservermogen, en het afstemmen van de twee de beelden met behulp van sub-resolutie microbolletjes. Voordat worden alle onderdelen van de microscoop ingeschakeld. De computer software worden vervolgens gestart en wordt verzekerd dat alle hardware componenten die door de software. Voor gebruik als co-lokalisatie standaard Verdun 1 pi sub-resolutie (0,2 pm) Fluoresbrite meerdere fluorescentielampen microsferen in 2 ml PBS en voeg 0,25 ml van de microsfeerophanging aan elk putje van een Lab-Tek II 8-goed chambered dekglaasje systeem (Nunc). Plaats de kamer schuif systeem op het platform boven de doelstelling. Kralen die worden geadsorbeerd op het glas worden dan in beeld gebracht. De Y uitlijning van de vezel XYZ start, wordt de positie van de laserstraal naar het midden van de achterkant apertuur van het objectief. Het is belangrijk te doen wanneer het doel in de positie waar het glas vlak is gericht. Als de bundel niet gecollimeerd, wordt de Z micrometer aangepast om volledige collimatie bereiken. Collimatie wordt afzonderlijk getest voor alle laser lijnen worden gebruikt in het experiment. In dit stadium wordt de laservermogen voor elke lijn gemeten met een laser vermogensmeter en aangepast 20-30 μW in elk kanaal. -T-cellen zijn zeer gevoelig voor laserstraling en de belichting wordt beperkt tot een totaal van 50 μW. Beelden van de parels worden verkregen met behulp van TIRF Illumination in de live-modus. Draai de Y-aanpassing micrometer op de vezel start zodat de bundel gaat bewegen van het plafond tot de hoek ten opzichte van optische as van het doel benaderingen 90 graden. Uiteindelijk, wanneer de kritische hoek voor TIR is bereikt, wordt het laserlicht niet meer verlaten doel. TIRF uitlijning wordt vervolgens beoordeeld door zich te richten op en neer door het vlak van het dekglaasje. Als kralen die drijven in oplossing kan worden gevisualiseerd dan de hoek van de bundel ten opzichte van de normale doel moet verder worden verhoogd. Op de juiste TIRF uitlijning, zal slechts een optisch vlak scherp zijn (dat wil zeggen, alleen de kralen die worden geadsorbeerd aan het dekglaasje). Een fijner test TIRF uitlijning kan worden toegepast bij beeldvorming T cellen gekleurd met een oppervlak kleurstof die verspreid over een oppervlak. (Zie punt 3.4). Na belichting TIRF is bereikt, kunnen de twee kanalen worden uitgericht ten opzichte van elkaar. Richten op de bolletjes en vergelijkt de positie van identifiable functies in de beelden die in beide kanalen. De X-en Y micrometer schroeven op een statief, brengen de relatieve positie van de korrels in zo dicht mogelijk. Sla de beelden van beide kanalen. Deze beelden worden gebruikt als co-lokalisatie standaard beide kanalen brengen. De camera's moeten zo worden gericht dat parfocaal ten opzichte van elkaar. Dit wordt bereikt door het verkrijgen van een reeks beelden van de deelreeks resolutie kralen die van elkaar gescheiden in de Z-richting door 100 nm. Als de maximum intensiteit pixel de kralen ligt in hetzelfde vlak voor de camera, dan zijn parfocaal. 3. Imaging Zodra de microscoop is ingesteld, de volgende taak is het voorbereiden van stromingskamers bevattende glazen ondersteund lipidendubbellagen presenteren antigeen en adhesie moleculen zoals eerder beschreven 6 en vervolgens uit te voeren TIRFM van getransfecteerde T-cellen de interactie met desubstraat. De gepubliceerde dubbellaag protocol 5-6 werd gevolgd zoals gepubliceerd behalve dat de liposomen niet geïncubeerd gedurende 20 minuten op de dekglaasje na stromingskamer werd geassembleerd. In plaats daarvan werd HBS-buffer BSA stroomde de meetcel onmiddellijk na montage. Monteer een stromingskamer met vlakke lipidendubbellagen gevormd op het glas dekglas met Ni-NTA lipiden. Adhesiemoleculen worden ICAM-1 (100 moleculen / um 2), peptide-MHC complexen, MCC geladen IE k (5-10 moleculen / um 2), die in de dubbellaag via de histidine-tags. De costimulatoire molecuul CD80 wordt toegevoegd met behulp van een GPI anker (100 moleculen / um 2). Zet de stroom cel op het podium van de microscoop en te stabiliseren. Bevestig de fabrikant meegeleverde verwarmingselement op de stroom cel om de temperatuur te regelen. Plaats de doelstelling op een bilaag en breng de bilaag vliegtuig in te richten. Schakel de verwarming van het doel en de stroomcel om de temperatuur van de kamer stabiliseren bij 37 ° C. Getransfecteerde cellen T pellet na 4 uur incubatie bij een snelheid van 80 x g en opnieuw gesuspendeerd in HBS-buffer BSA en aangevuld met 10 ug / ml H57 Fab of 20 ug / ml H57 enkele keten variabel fragment (scFv) om het etiket van de TCR. De cellen worden vervolgens geïnjecteerd in de stroom cellen. Imaging gebeurt in voortdurende aanwezigheid van de Fab of scFv vanwege hun hoge dissociatieconstante. De aanwezigheid in het medium niet significant stijging van de achtergrond als TIRF veld erg dun. Imaging voorwaarden zijn zo opgezet dat twee-kanaals live-overname toont een live preview van de TCR en GFP-kanalen die helpt bij het zoeken naar getransfecteerde cellen. TIRF verlichting wordt bevestigd door zich te richten op het glas vliegtuig naar een laterale membraankleuring op te sporen. Als laterale membranen komen niet in beeld dan is de TIRF uitlijning is goed. Getransfecteerde cellen worden dan een keer of in een sequentie van beelden afgebeeld op vid producereneos. 4. Image Processing en data-analyse De software voert beelden van de twee camera's in een frame. De uitgang van elke camera is 512 x 512 pixels, zodat de uitgang beeld 1024 x 512 pixels. De beelden eerst te verdelen in afzonderlijke beelden overeenkomen met de twee camera's. De beelden van sub-resolutie kralen van de twee kanalen zijn bedekt en aanpassing parameters worden bepaald. Een specifiek kenmerk ons systeem is een graden rotatie van een kanaal ten opzichte van de andere (zie figuur 3). De meest waarschijnlijke bron van deze rotatie is de camera staat. Na deze rotatie verdere relatieve lineaire transformaties X en Y moeten worden uitgevoerd om de korrels perfect uitlijnen ten opzichte van elkaar. Beelden van kralen worden verkregen in elk experiment om de precieze parameters te bepalen om de twee kanalen uit te lijnen. Deze lineaire en rotatie transformaties toegepast op defoto's en dan zijn ze onderworpen aan segmentatie algoritmen en co-localisatie analyse. 5. Representatieve resultaten Het hier beschreven systeem kan worden aangepast aan signaal stroomafwaarts van elke receptor bestuderen de plasmamembraan. Het is vooral informatief in het bestuderen van TCR signalisatie, omdat signalering vindt plaats in optisch opgelost clusters genoemd TCR microclusters of in endosomen zoals onlangs 18 beschreven. Als signalering deed zich voor in sub-resolutie clusters van receptoren of in niet-geclusterde receptoren aanvullende experimenten zou moeten worden gedaan om de gegevens te interpreteren. Zoals eerder vermeld, CD3 ketens van de TCR complex ondergaan fosforylering door Src familie kinase Lck tijdens het inschakelen van de TCR de peptide-MHC complexen. De gefosforyleerde CD3ζ keten werft dan is de Syk familie kinase Zap70. Het visualiseren van de werving van Zap70 rapporteert dus op de fosforylatie status van CD3ζ keten. De sterkte van TCR stimulatie kan worden veranderd door peptiden gemuteerd op de TCR contact residuen. Dergelijke peptiden worden gewijzigd genoemd peptide liganden (antipersoneelmijnen). Een representatief experiment wordt getoond in figuur 4 waar de agonist peptiden stevig Zap70 rekruten TCR microclusters terwijl minder sterk peptide T102L niet Zap70 rekruteren TCR microclusters, waaruit blijkt dat de ketting niet CD3ζ gefosforyleerd in dit geval. We konden trekken deze conclusie omdat we moesten gewoon houden aan de werving van Zap70 voor TCR clusters die eenvoudig werden gedetecteerd door TIRFM. Een geautomatiseerd segmentatie algoritme werd gebruikt om het aantal Zap70 microclusters per cellen. Ook getoond in de aanvullende film is de gelijktijdige beeldvorming van TCR en Zap70 bijbehorende fluorescentie. Let op het dynamische karakter van lamelipodium. <br /> Figuur 1. Image en schematische voorstelling van de aangepaste TIRF lancering. Paneel A toont een foto van de TIRF lancering als geïnstalleerd op de microscoop en Paneel B is een schema van de TIRF start waaruit de lichtweg. De schematisch en plaatje van de toestand van de verzamelaar lens, de bundeldeler, de vezel start met X, Y en Z aanpassingen de collimerende lens L1 en L2 de focusseerlens geplaatst in de dichroïsche kubus en TIRF doel. De inzet geeft de focusseerlens geplaatst in de dichroïsche kubus. Figuur 2. Beeld en schema van het systeem met twee camera. Paneel A toont de foto van het systeem met twee camera als aan de microscoop en Paneel B is een schema van dezelfde. Het schema en beeld tonen de positie van het objectief, spiegel, dichroïsche, buis lenzen TL1 en TL2, emissie-filters F1 en F2, de twee camera's C1 en C2 op terfgenaam staat met hun X, Y en Z aanpassingen. Figuur 3. Het gebruik van sub-resolutie kralen om de twee kanalen uit te lijnen. Panelen A en B tonen overlays sub-resolutie korrels vóór (panel A) en na (panel B) uitgelijnd. Paneel A toont dat een van de kanalen is gedraaid ten opzichte van de andere. Panelen C en D zijn een sub deel van de beelden in A en B. Panel E toont een twee-kanaals overlay beeld van cellen zonder verwerking. Alignment parameters in paneel D zijn toegepast op het beeld zoals getoond in paneel F. Merk op dat het lamelipodium van de twee kanalen perfect op een lijn in paneel F en niet in paneel E. Schalingsbalk 4 micrometer voor de panelen. Figuur 4. Zap70 rekrutering van TCR microclusters in reactie op verschillende antipersoneelmijnen. In-vitro-geactiveerde EN T cellen werden getransfecteerd met een plasmide dat codeert Zap70 gefuseerd GFP en geïncubeerd op glas ondersteunde Ni-NTA dubbellagen met 6 moleculen / um 2 peptide geladen His-tag-IE k, 100 moleculen / um 2 Alexa647-geconjugeerd His-tag ICAM- 1 en 100 moleculen / um 2 van de GPI-verankerd CD80. De peptiden geladen zijn in de inzet. ICAM-1 verwijst naar cellen die dubbellagen 100 moleculen / um 2 Alexa-647 geconjugeerd His-tag ICAM-1. Dual channel gelijktijdige overname TIRF microscopie werd uitgevoerd in de continue aanwezigheid van Alexa546 geconjugeerde H57 Fab-fragment (non-blocking) om de TCR vlek. Cellen werden afgebeeld tot een uur na het eerste contact met de bilaag. Aantal Zap70 clusters per cel werden geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerd cluster tellen software. Ten minste 40 cellen werden in elk geval. Schaal bar 2 micrometer voor alle beelden. 92/3892fig5.jpg "/> Figuur 5. Aanpassing van het systeem met twee camera met twee verschillende camera's. Dit paneel toont de lijn overlay van sub-resolutie kralen afgebeeld met de twee camera systeem waarbij de twee camera's hebben verschillende pixel-maten (Groen: 6,45 micrometer pixelgrootte afgebeeld op 2×2 binning en Red: 16 micrometer pixelgrootte afgebeeld zonder binning). Inzet toont de vergrote weergave van de vierkante doos in het midden van het veld. Schaal bar 5 micrometer. Aanvullende Movie. Zap70 rekrutering van TCR microclusters in reactie op agonist peptide. In-vitro geactiveerde en T-cellen werden getransfecteerd met een plasmide dat codeert Zap70 gefuseerd GFP en geïncubeerd op glas ondersteunde Ni-NTA dubbellagen met 6 moleculen / um 2 peptide geladen His-tag-IE k, 100 moleculen / um 2 Alexa647 geconjugeerd His-tag ICAM-1 en 100 moleculen / um 2 GPI verankerd CD80. Dual-channel gelijktijdig eencquisition TIRF microscopie werd uitgevoerd in de continue aanwezigheid van Alexa546 geconjugeerde H57 Fab-fragment (non-blocking) om de TCR vlek. Een gebied van getransfecteerde cellen werd herhaald afgebeeld 40 keer met een tijd resolutie van 10 seconden per frame. Schaal bar 2 micrometer. Klik hier om aanvullende film te bekijken .
