YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi
Summary
Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Abstract
Tüm fare organlarının içsel floresans ve ikinci harmonik üretimi (SHG) arasında Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün olmaktadır. 1,2 Ancak, GFP ve YFP olarak floresan proteinleri içeren organlar, metanol kullanan optik temizleme protokollerinin benzil alkol kullanarak dehidratasyon ve net: ışık 3 korumasız ise benzil benzoat (Babb) floresan sinyal korumak yok. Burada sunulan protokol nöronlarda eksprese YFP floresan sinyal koruyarak fare beyni üzerindeki tüm organ optik temizleme gerçekleştirmek için hangi yeni bir yoludur. Org floresan protein için hasarı azaltmak ve multiphoton görüntüleme için onların floresan sinyalini korumak için yararlı olan bir dizi dereceli etanol kullanılarak susuz olduğu bu tür optik açıklığa protokol değiştirilmesi. 4 etanol-tabanlı dehidrasyon ile optik açıklığın iyileştirilmiş bir yöntem ile Babb ile takasışıktan korumalı ise, biz doku yüzeyinin altında 2 mm'den daha fazla bir fare beyin nöronları sarı floresan proteini (YFP) İfade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Protocol
Discussion
Standart organik boyalar organik çözücülerin bir yelpazesi ile uyumlu ve bu nedenle protokoller temizlemek için özel bir sorun teşkil etmez iken, floresan proteinleri çözücü sıklıkla değişiklikler az hoşgörülü. Mevcut çalışma 4 hedefi ciddi bir sınırlama üstesinden oldu XFPs floresan kayıp veya ölçüde düşer Bir önceki optik temizleme protokolleri. Burada sunulan görüntüler YFP gelen floresans korunmuş olduğunu göstermektedir. Burada anlatılan optik temizleme tekniği dok…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz video düzenleme yaptığı yardım için Jacob Solis teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma MJ Levene bir NSF KARİYER Ödülü DBI-0953902 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
Referências
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
