Enkelt-celle Profilering af at udvikle og Ældre retinaneuroner
Summary
En fremgangsmåde til isolation af enkelte retinale celler og efterfølgende amplifikation af de cDNA'er beskrevet. Encellede transcriptomics viser graden af cellulær heterogenitet er til stede i et væv og afdækker nye markørgener for sjældne cellepopulationer. Den ledsagende protokol kan tilpasses mange forskellige celletyper.
Abstract
Meget specialiserede, men umådelig lille populationer af celler spiller en vigtig rolle i mange væv. Identifikation af celletype-specifikke markører og genekspression programmer for ekstremt sjældne celledelmængder har været en udfordring ved anvendelse af standard hel-væv fremgangsmåder. Genekspression profilering af de enkelte celler giver mulighed for hidtil uset adgang til celletyper, der udgør kun en lille procentdel af den samlede væv 1-7. Desuden kan denne teknik anvendes til at undersøge genekspressionssystemer programmer, der transient udtrykt i små antal celler under dynamiske udviklingsmæssige overgange 8.
Dette problem af cellulær mangfoldighed opstår gentagne gange i centralnervesystemet (CNS), hvor neuronale forbindelser kan forekomme mellem ganske forskellige celler 9. Det nøjagtige antal af distinkte celletyper er ikke nøjagtigt kendt, men det er blevet skønnet, at der kan være så mange som 1000 forskellige typer i cortex itself 10. Funktionen (r) af komplekse neurale kredsløb kan stole på nogle af de sjældne neuronale typer og de gener, de udtrykker. Ved at identificere nye markører og bidrager til molekylært klassificere forskellige neuroner, er det enkelt-celle fremgangsmåde særligt nyttige i undersøgelsen af celletyper i nervesystemet. Det kan også bidrage til at belyse mekanismerne for neural udvikling ved at identificere differentielt udtrykte gener og gen-veje i de tidlige stadier af neuronal stamfader udvikling.
Som en enkel, let tilgængelige væv med stor neuronal mangfoldighed er vertebrat nethinden en fremragende model-system til undersøgelse af processerne i cellulære udvikling neuronal differentiering og neuronal differentiering. Men som i andre dele af CNS, kan det cellulære mangfoldighed udgør et problem for fastlæggelse af de genetiske veje, der driver retinale stamfædre til at vedtage en bestemt celle skæbne, især i betragtning af, at stavfotoreceptorer udgør maHovedparten af den totale retinal cellepopulation 11. Her rapporterer vi en fremgangsmåde til identifikation af transkripter udtrykt i enkelte retinale celler (figur 1). Den encellede profilering teknik muliggør vurderingen af mængden af heterogenitet stede i forskellige cellulære populationer af nethinden 2,4,5,12. Desuden har denne fremgangsmåde vist en række nye kandidatgener som kan spille rollen (er) i celleskæbnen beslutningsprocesser, der forekommer i delmængder af retinale progenitorceller 8. Med nogle enkle justeringer af protokollen, kan denne teknik kan anvendes til mange forskellige væv og celletyper.
Protocol
Discussion
Et stadigt voksende antal undersøgelser afsløre robust celle-til-celle variation i populationer, der menes at være mere homogene med hensyn til deres genekspression 6,8. I mindst et tilfælde har denne genekspression "støj" blevet vist at spille en vigtig biologisk funktion 13. Genekspressionssystemer forskelle mellem individuelle celler er dækket ved hjælp af traditionelle hel-væv metoder. Disse eksperimenter generere ekspressionsprofilen af et "gennemsnitligt" celle, so…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
| 0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 0.23 μl | 10% NP-40 |
| 0.23 μl | 0.1M DTT |
| 0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
| 0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
| 0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
| 0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
| 3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
| 0.18 μl | 100 mM dATP |
| 0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 4.62 μl | dH2O |
| 0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
| 0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
| 10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
| 10 μl | 2.5 mM dNTPs |
| 0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
| 1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
| 68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
| 0.5M | Potassium acetate |
| 0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
| 0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
| Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
| Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
| Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
| HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| DNase I | Roche | 04716728001 | |
| papain | Worthington | LS03126 | |
| Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
| T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
| Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
| TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
| RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
| Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
- Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
- Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
- Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
- Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
- Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
- Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
- Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
- Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
- Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
- Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
- Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
- Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
- Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
- Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
- Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
- McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
- Gelder, R. N. V. a. n. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
- Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
- Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
- Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).
