De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina
Summary
Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.
Abstract
Populações altamente especializados, mas muito pequena de células desempenham um papel importante em muitos tecidos. A identificação de célula do tipo marcadores específicos e programas de expressão do gene para subconjuntos de células extremamente raras tem sido um desafio usando padrão de tecido todo de abordagens. Perfilamento gene expressão de células individuais permite um acesso sem precedentes para tipos de células que compreendem apenas uma pequena percentagem do tecido total de 1-7. Além disso, esta técnica pode ser usado para examinar os programas de expressão génica que são transitoriamente expressa em pequenos números de células durante dinâmicas transições de desenvolvimento 8.
Este problema surge da diversidade celular repetidamente no sistema nervoso central (CNS) onde as ligações neuronais pode ocorrer entre as células bastante diversas 9. O número exacto de tipos de células distintas não é conhecida com precisão, mas estima-se que pode haver até 1000 tipos diferentes no i córtextself 10. A função (s) de complexos circuitos neurais podem contar com alguns dos tipos raros neuronais e os genes se expressam. Através da identificação de novos marcadores e ajudando a molecularmente classificar neurónios diferentes, a abordagem de uma única célula é particularmente útil na análise de tipos de células no sistema nervoso. Pode também ajudar a elucidar os mecanismos de desenvolvimento neural, identificando genes diferencialmente expressos e vias de genes durante os estágios iniciais de desenvolvimento neuronal progenitor.
Como um tecido, de fácil acesso simples com a diversidade considerável neuronal, a retina vertebrado é um sistema modelo excelente para estudar os processos de desenvolvimento celular, diferenciação neuronal e diversificação neuronal. No entanto, como em outras partes do SNC, esta diversidade celular pode apresentar um problema para determinar os caminhos genéticos que levam progenitores da retina de adotar um destino célula específica, especialmente dado que os bastonetes compõem a maria da população total de células da retina 11. Relatamos aqui um método para a identificação dos transcritos únicos expressos em células da retina (Figura 1). A técnica de perfis de célula única permite a avaliação da quantidade de heterogeneidade presente em diferentes populações celulares da retina 2,4,5,12. Além disso, este método tem revelado uma série de novos genes candidatos que podem desempenhar um papel (s) no destino da célula de tomada de decisão processos que ocorrem em subconjuntos de células progenitoras da retina 8. Com alguns ajustes simples para o protocolo, esta técnica pode ser utilizada para muitos tecidos diferentes e tipos de células.
Protocol
Discussion
Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica 6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão "ruído" tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica 13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o per…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
| 0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 0.23 μl | 10% NP-40 |
| 0.23 μl | 0.1M DTT |
| 0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
| 0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
| 0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
| 0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
| 3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
| 0.18 μl | 100 mM dATP |
| 0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 4.62 μl | dH2O |
| 0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
| 0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
| 10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
| 10 μl | 2.5 mM dNTPs |
| 0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
| 1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
| 68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
| 0.5M | Potassium acetate |
| 0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
| 0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
| Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
| Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
| Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
| HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| DNase I | Roche | 04716728001 | |
| papain | Worthington | LS03126 | |
| Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
| T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
| Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
| TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
| RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
| Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
- Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
- Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
- Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
- Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
- Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
- Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
- Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
- Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
- Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
- Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
- Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
- Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
- Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
- Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
- Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
- McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
- Gelder, R. N. V. a. n. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
- Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
- Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
- Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).
