Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex
Summary
Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.
Abstract
Herpes simpleks tip 1 (HSV-1) periferik nöronlarda bir ömür boyu gizli bir enfeksiyon oluşturur simpleks virüsü. Bu gizli rezervuar iletimi sağlamak ve klinik hastalığı katkıda tekrarlayan reaktivasyon olayların kaynağıdır. Şu antiviral gizli rezervuar etkisi yoktur ve hiçbir aşılar vardır. Litik replikasyon moleküler ayrıntıları iyi karakterize iken, nöronlarda gecikme kontrol mekanizmaları zor kalır. Gecikme Bizim bugünkü anlayış viral gen gereksinimleri ve immün yanıtın rolü tanımlamak için vazgeçilmez olan küçük hayvan modelleri kullanılarak in vivo çalışmalar türetilmiştir. Bununla birlikte, canlı hayvanlarda bağışıklık veya non-nöronal destek hücreleri tarafından aracılık enfeksiyon daha genel sonuçlarından virüsü-nöron ilişkiyi spesifik etkileri ayırt etmek imkansızdır. Buna ek olarak, hayvan deney ev sahibi manipüle edilmesi için, masraflı zaman alıcı ve seçenekler açısından sınırlıdırsüreçleri. Bu sınırlamaları aşmak için, bir nöron sadece sistem umutsuzca gecikme ve reaktivasyonu in vivo özellikleri üretir ama homojenlik ve erişilebilirlik açısından doku kültürü faydalar sunduğunu gereklidir.
Burada uyan HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu okumaya sıçan üstün servikal gangliya (SCG) (Şekil 1) kültürlerinde birincil sempatik nöronlar kullanan bir in vitro model sunmak en değil, istenen tüm kriterleri eğer. Non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırarak sonra, yakın homojen TrkA + nöron kültürleri litik çoğaltma bastırmak için asiklovir varlığı (ACV) HSV-1 ile enfekte olmaktadır. Aşağıdaki ZMA kaldırılması, sadakatle gecikme kabul işaretlerinden verimli kurulan sergilemek üretken olmayan HSV-1 enfeksiyonları. Özellikle, litik mRNA, protein ve bulaşıcı virüsün bile seçimi yokluğunda, farkedilmezler.Örneklerini, ancak gecikme ile ilişkili transkript (LAT) ekspresiyon nöronal çekirdeklerinde devam. Viral genomu nöron başına ortalama 25 kopya sayısında korunur ve verimli PI3-Kinaz / Akt sinyal veya sinir büyüme faktörü 1 basit çekilmesi ile müdahale ederek çoğaltmak için bağlı olabilir. Viral proteini litik Us11 füzyonlu bir rekombinant HSV-1 kodlama EGFP kolaylıkla ölçülür kaynaklanan replikasyon aktive için işlevsel, gerçek zamanlı işaretleyici sağlar. Kimyasal işlemler ek olarak, bu tür lentiviral vektörler aracılığıyla RNA-etkileşim veya gen aktarımının gibi genetik metodolojiler başarılı bir şekilde çok zordur, imkansız olmasa, hayvanlarda olan mekanik çalışmalar izin sistemine uygulanabilir. Özetle, SCG tabanlı HSV-1 gecikme / reaktivasyon sistemi nöronlarda HSV1 gecikme ve reaktivasyonu olan çözüm bu yeni tedavilerin geliştirilmesi taze bakış açısı sunabilir viroloji köklü bir bulmaca kontrol eden moleküler mekanizmalar çözülmeye güçlü, gerekli bir araç sağlar hedef tdiye herpesvirus rezervuar gizli.
Protocol
Discussion
Bu primer nöron kültürü ve enfeksiyon sistemi HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar. Sistem sadakatle özetlediği insan enfeksiyonları hem de hem canlı hayvan modellerinde belirlenen gecikme kabul özellikleridir. Virüs SCG kültürlerinde gizli olduğunda, bulaşıcı parçacıklar ve viral litik gen ürünleri tespit edilemez. Latent enfekte nöron tespit sadece viral gen ürünü çekirdeklerin içinde biri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının geliştirmek için yardımcı onların düşünceli önerileriniz için teşekkür değerlendirenler. Bu çalışma NIH MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) ve IM (AI073898, GM056927) hibe ile desteklenmiştir. MK bir NIH eğitim bursu (5T32 AI007180) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referências
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
- Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
- Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
- Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
- Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
- Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
- Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
- Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
- Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
- Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
- Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
- Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
- Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
- Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
- Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
- Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
- Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
- Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
- Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
- Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
- Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).
