Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung
Summary
Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.
Abstract
Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1) stellt eine lebenslange latente Infektion in peripheren Neuronen. Dieses latente Reservoir ist die Quelle der wiederkehrenden Ereignissen, die Reaktivierung Übertragung zu gewährleisten und dazu beitragen, klinischen Erkrankung. Aktuelle antivirale Medikamente haben kaum Auswirkungen auf das latente Reservoir und es gibt keine Impfstoffe. Während die molekularen Details der Virusvermehrung gut charakterisiert sind, bleiben Mechanismen, die Latenz in den Neuronen schwer fassbar. Unser gegenwärtiges Verständnis von Latenzzeiten von In-vivo-Studien mit kleinen Tiermodellen, die zur Definition der virale Gen Anforderungen und die Rolle der Immunreaktionen wurden unentbehrlich abgeleitet. Jedoch ist es unmöglich, spezifische Wirkungen auf die Virus-Neuron-Verhältnis von mehr allgemeinen Folgen der Infektion durch Immun oder nicht-neuronalen Zellen Unterstützung in lebenden Tieren vermittelt unterscheiden. Darüber hinaus ist Tierversuchen kostspielig, zeitaufwendig und im Hinblick auf die begrenzten verfügbaren Optionen für die Manipulation von HostVerfahren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird ein Neuron-System nur, dass dringend benötigte reproduziert die in vivo Eigenschaften von Latenz und Reaktivierung, sondern bietet die Vorteile von Gewebekulturen in Bezug auf die Homogenität und Zugänglichkeit.
Hier präsentieren wir ein in vitro Modell unter Verwendung von kultivierten primären sympathischen Neuronen von Ratten überlegen Halsganglien (SCG) (Abbildung 1) zu HSV-1-Latenz und Reaktivierung, die passt zu studieren meisten, wenn nicht alle gewünschten Kriterien. Nach Beseitigung nicht-neuronalen Zellen, sind nahezu homogen TrkA + Neuronenkulturen mit HSV-1 in Anwesenheit von Acyclovir (ACV) die lytische Vermehrung zu unterdrücken infiziert. Nach der Entfernung ACV, nicht-produktive HSV-1-Infektionen, die treu zeigen akzeptiert Markenzeichen der Latenz werden effizient etabliert. Insbesondere werden lytischen mRNAs, Proteine, und das infektiöse Virus nicht nachweisbar, auch in Abwesenheit der Auswahl, aber Latenz-assoziierten Transkript (LAT) exprimierenIonen besteht in neuronalen Kerne. Virale Genome mit einer durchschnittlichen Anzahl von 25 Kopien pro Neuron gehalten und können zur produktiv zu stören PI3-Kinase / Akt Signalisierung oder Rücknahme eines Nerven Wachstumsfaktor 1 zu replizieren. Rekombinantes HSV-1-Codierung EGFP fusioniert mit dem lytischen Proteins US11 eine funktionale Echtzeit-Marker für die Replikation durch die Reaktivierung, die leicht quantifiziert wird. Zusätzlich zu den chemischen Behandlungen können genetische Methoden wie RNA-Interferenz oder Gentransfer über lentiviralen Vektoren erfolgreich auf das System ermöglicht mechanistische Studien, die sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, bei Tieren angewendet werden. Zusammenfassend bietet die SCG-basierten HSV-1-Latenz / Reaktivierung System eine leistungsstarke, notwendiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen, die HSV1 Latenz und Reaktivierung in Neuronen, ein langjähriger Rätsel, dessen Lösung in der Virologie können neue Einblicke in die Entwicklung neuer Therapien anbieten zu entwirren, dass Ziel ter latent Herpesvirus Reservoir.
Protocol
Discussion
Diese primäre Neuron Kultur und Infektion System bietet eine einfache und effektive Methode, um die molekularen Mechanismen HSV-1-Latenz und Reaktivierung zu erkunden. Das System treu rekapituliert die anerkannten Markenzeichen der Latenz in beiden Infektionen beim Menschen und bei Live-Tiermodellen definiert. Wenn das Virus in den SCG Kulturen latent ist, können infektiöse Partikel und lytischen Genprodukte nicht nachgewiesen werden. Die einzige virales Genprodukt in latent infizierten Neuronen, wir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Gutachtern für ihre durchdachten Vorschläge, die dieses Manuskript zu verbessern half. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) und IM (AI073898, GM056927) von der NIH unterstützt. MK wurde zum Teil durch ein NIH Ausbildungsförderung (5T32 AI007180) unterstützt.
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referências
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