Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie
Summary
Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.
Abstract
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) wordt een leven lang latente infectie in de perifere neuronen. Dit latente reservoir is de bron van terugkerende reactivering gebeurtenissen te verzekeren dat de en bijdragen aan klinische ziekte. De huidige antivirale middelen hebben geen invloed op de latente reservoir en er zijn geen vaccins. Terwijl de moleculaire details van lytische replicatie zijn goed gekarakteriseerd, mechanismen die de latentie in neuronen blijven ongrijpbaar. Onze huidige kennis van latentie is afgeleid van in vivo studies met kleine diermodellen, die zijn onmisbaar voor het definiëren van virale gen-eisen en de rol van de immuunrespons. Het is echter niet te onderscheiden specifieke effecten op het virus neuron relatie van meer algemene gevolgen van infectie gemedieerd door immuun-of niet-neuronale ondersteuning cellen in levende dieren. Daarnaast dierproeven is kostbaar, tijdrovend, en beperkt in termen van beschikbare opties voor het manipuleren van gastheerprocessen. Om deze beperkingen te overwinnen, is een neuron-only systeem hard nodig dat reproduceert de in vivo eigenschappen van latentie en reactivatie, maar biedt de voordelen van weefselkweek op het gebied van homogeniteit en toegankelijkheid.
Hier presenteren we een in vitro model gebruik te maken van gekweekte primaire sympathische neuronen van de rat superieure cervicale ganglia (SCG) (figuur 1) tot HSV-1 latentie en reactivatie dat past studie zijn de meeste zo niet alle van de gewenste criteria. Na verwijderen van niet-neuronale cellen, nagenoeg homogene TrkA + neuron kweken geïnfecteerd met HSV-1 in aanwezigheid van acyclovir (ACV) tot lytische replicatie onderdrukken. Na ACV verwijdering, niet-productieve HSV-1 infecties die trouw vertonen aanvaarde kenmerken van latency op efficiënte wijze vastgesteld. Met name lytische mRNAs, eiwitten en infectieuze virus meer detecteerbaar, zelfs in de afwezigheid van selectie, maar latentie-geassocieerde transcript (LAT) expression blijft in neuronale kernen. Virale genomen worden gehandhaafd op gemiddeld aantal kopieën van 25 per neuron en kan worden geïnduceerd om productief te repliceren door te interfereren met PI3-kinase / Akt signalisatie of de eenvoudige intrekking van zenuwgroeifactor 1. Een recombinant HSV-1 codering EGFP gefuseerd met het virale eiwit US11 lytische zorgt voor een functionele, real-time marker voor replicatie voortvloeien uit de reactivering die gemakkelijk wordt gekwantificeerd. Naast chemische behandelingen kunnen genetische methoden zoals RNA-interferentie of genafgifte via lentivirale vectoren succes worden toegepast op het systeem waarmee mechanistische studies die zeer moeilijk, zo niet onmogelijk, bij dieren. Kortom, de SCG op basis van HSV-1 latency / reactivering systeem zorgt voor een krachtige, noodzakelijk instrument om de moleculaire mechanismen die HSV1 latentie en reactivatie in neuronen, van oudsher een puzzel in de virologie waarvan de oplossing kan nieuwe inzichten bieden in het ontwikkelen van nieuwe therapieën die te ontrafelen doelstelling thij latent herpesvirus reservoir.
Protocol
Discussion
Deze primaire neuron cultuur en infectie systeem biedt een eenvoudige en effectieve methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen HSV-1 latentie en reactivatie te verkennen. Het systeem trouw recapituleert de algemeen aanvaarde kenmerken van vertraging in de zin van zowel menselijke infecties en in live-diermodellen. Wanneer het virus latent aanwezig in de SCG culturen, kunnen besmettelijke deeltjes en virale lytische genproducten niet worden gedetecteerd. De enige virale genproduct ged…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de reviewers voor hun doordachte suggesties die heeft geholpen bij dit manuscript te verbeteren. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) en IM (AI073898, GM056927) van de NIH. MK werd mede ondersteund door een NIH-subsidie training (5T32 AI007180).
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referências
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
- Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
- Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
- Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
- Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
- Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
- Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
- Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
- Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
- Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
- Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
- Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
- Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
- Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
- Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
- Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
- Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
- Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
- Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
- Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
- Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).
