والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط
Summary
بروتوكول يصف نظام فعال وقابلة للتكرار نموذج لدراسة فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) الكمون وتنشيط. الفحص توظف متجانسة الثقافات الخلايا العصبية متعاطف، ويسمح للتشريح الجزيئية للفيروس الخلايا العصبية التفاعلات باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات بما في ذلك تدخل الجيش الملكي النيبالي والتعبير من البروتينات المؤتلف.
Abstract
فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) يضع العدوى الكامنة مدى الحياة في الخلايا العصبية الطرفية. هذا خزان كامن هو مصدر الأحداث المتكررة التي تكفل إعادة تنشيط النقل وتسهم في المرض السريري. الأدوية المضادة للفيروسات الحالية لا تؤثر على خزان كامنة وأنه لا توجد لقاحات. في حين أن تفاصيل الجزيئي للتكرار التحللي هي جيدة تتميز، وآليات السيطرة على كمون في الخلايا العصبية لا تزال بعيدة المنال. مشتق من فهمنا الحالي للكمون من الدراسات المجراة في استخدام النماذج الحيوانية الصغيرة، التي لا غنى عنها لتحديد الاحتياجات الجينات الفيروسية ودور الاستجابات المناعية. ومع ذلك، فإنه من المستحيل التمييز بين آثار محددة على علاقة الفيروسات الخلايا العصبية من عواقب وأعم من العدوى بوساطة خلايا المناعة أو الدعم غير العصبية في الحيوانات الحية. وبالإضافة إلى ذلك، التجارب على الحيوانات غير مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، ومحدودة من حيث الخيارات المتاحة لمعالجة مضيفالعمليات. للتغلب على هذه القيود، وهناك حاجة ماسة إلى نظام الخلايا العصبية فقط أن يستنسخ في خصائص الجسم الحي من الكمون وإعادة تنشيط لكنه لم يقدم فوائد زراعة الأنسجة من حيث التجانس وسهولة الوصول إليها.
نحن هنا يقدم في المختبر باستخدام نموذج مثقف الخلايا العصبية متعاطف الأولية من العقد الفئران عنق الرحم متفوقة (SCG) (الشكل 1) لدراسة HSV-1 الكمون وتنشيط يلائم معظم إن لم يكن كل من المعايير المطلوبة. بعد القضاء على الخلايا غير العصبية، يصاب شبه متجانسة TrkA + الثقافات الخلايا العصبية مع HSV-1 في وجود الأسيكلوفير (ACV) لقمع تكرار التحللي. التالية ACV إزالة، غير منتجة HSV-1 الإصابات التي تعرض بأمانة وضعت بصمات بكفاءة مقبولة من الكمون. والجدير بالذكر أن mRNAs التحللي، والبروتينات، والفيروسات المعدية تصبح غير قابلة للكشف، حتى في حالة عدم وجود اختيار، ولكن استتار المصاحب لنص (LAT) صريحةايون استمرت في نوى الخلايا العصبية. تتم المحافظة على الجينوم الفيروسي في عدد نسخة من متوسط 25 في الخلايا العصبية، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتكرار منتجة عن طريق التداخل مع PI3-كيناز / AKT إشارات أو انسحاب بسيط من عامل نمو الأعصاب 1. والمؤتلف HSV-1 EGFP ترميز تنصهر في Us11 بروتين فيروسي التحللي يوفر وظيفية، في الوقت الحقيقي وعلامة للحصول على النسخ الناتجة عن إعادة تنشيط أن كميا بسهولة. بالإضافة إلى العلاج الكيميائي، ويمكن منهجيات الوراثية مثل تسليم الحمض النووي الريبي التدخل أو الجينات النواقل lentiviral تطبيقها بنجاح على نظام السماح للدراسات الآلية التي من الصعب جدا، إن لم يكن مستحيلا، في الحيوانات. وباختصار، فإن SCG المستندة إلى HSV-1 كمون / تنشيط نظام يوفر قوية، وأداة ضرورية لكشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في HSV1 الكمون وتنشيط الخلايا العصبية في، لغزا محيرا منذ وقت طويل في علم الفيروسات التي قد تقدم حلا رؤى جديدة لتطوير علاجات جديدة هدف تيكان كامنا خزان هربس.
Protocol
Discussion
هذه الثقافة الخلايا العصبية الأولية ونظام عدوى يوفر طريقة بسيطة وفعالة لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء HSV-1 الكمون وتنشيط. نظام يلخص بأمانة بصمات المقبولة من الكمون المحددة في كل من الإصابات البشرية والحيوانات الحية من النماذج. عندما يكون الفيروس كا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المقيمين على اقتراحاتهم مدروس التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المنح لMVC (NS21072، HD23315)، ACW (GM61139، S10RR017970) والدردشة (AI073898، GM056927) من المعاهد الوطنية للصحة. وأيد عضو الكنيست في جزء من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (5T32 AI007180).
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referências
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
- Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
- Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
- Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
- Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
- Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
- Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
- Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
- Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
- Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
- Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
- Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
- Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
- Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
- Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
- Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
- Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
- Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
- Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
- Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
- Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).
