Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse
Summary
Diese Studie beschreibt eine neue Mikrotiterplatte Assay, FV Gerinnungsaktivität misst während Fibrin Gerinnselbildung in Humanplasma, die zuvor noch nicht gemeldet. Das Verfahren verwendet eine kinetische Mikroplattenleser das kontinuierliche Messen der Änderung der Absorption bei 405 nm während Fibrin Gerinnselbildung in humanem Plasma.
Abstract
In Reaktion auf eine Verletzung ist die Blutgerinnung aktiviert und führt zur Erzeugung der Gerinnungszeit Protease, Thrombin. Thrombin spaltet Fibrinogen zu Fibrin bildet eine unlösliche Klumpen, die Blutung stoppt. Faktor V (FV) in seiner aktivierten Form, FVa, ist ein kritischer Cofaktor für die Protease Faktor Xa und Beschleuniger der Thrombinbildung während Fibrin Gerinnselbildung als Teil Prothrombinase 1, 2. Manuelle FV Assays wurden 3, 4 beschrieben, aber sie sind zeitaufwendig und subjektiv. Automatisierte FV Assays wurden beschrieben 5-7, aber der Analysator und Reagenzien sind teuer und in der Regel lediglich die Gerinnungszeit, nicht die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Fibrinbildung. Die Mikrotiterplatte Plattform zur Messung enzymkatalysierten Veranstaltungen wegen der Bequemlichkeit bevorzugt, Zeit, Kosten, kleines Volumen, kontinuierliche Überwachung und High-Throughput-8, 9. Microplate Assays wurden für Gerinnsel-Lyse 10, Thrombozytenaggregation gemeldet11 und Gerinnungsfaktoren 12, jedoch nicht für FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Das Ziel des Verfahrens war es, eine Mikroplatten-Assay, der FV-Aktivität misst während der Fibrinbildung in humanem Plasma zu entwickeln.
Diese neuartige Mikroplatte Verfahren stellt eine einfache, kostengünstige und rasche Bestimmung von FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser die Extinktionsänderung bei 405 nm während der Fibrinbildung in Humanplasma (Abbildung 1) 13 zu überwachen. Der Assay misst genau die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Es erfordert nur ul Mengen von Plasma ist in 6 min abgeschlossen hat hohem Durchsatz, ist empfindlich gegen 24-80pM FV, und misst die Menge an unbeabsichtigt betätigt (1-stufig Aktivität) und Thrombin-aktivierten FV (2-Stufen-Aktivität ), um eine umfassende Beurteilung des gesamten funktionelle Aktivität (2-stufig Aktivität – 1-Stufen-Aktivität).
Disseminierte intravasdere Gerinnung (DIC) ist eine erworbene Gerinnungsstörungen, die am häufigsten entwickelt sich aus bereits bestehenden Infektionen 14. DIC ist mit einer schlechten Prognose und erhöht die Mortalität über dem bereits bestehenden Pathologie 15 zugeordnet. Der Assay wurde verwendet, um zu zeigen, dass in 9 Patienten mit DIC, der FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Tätigkeiten verringert wurden, im Durchschnitt um 54%, 44% und 42%, verglichen mit normalen gepoolten menschlichen Referenz-Plasma (NHP).
Der FV Mikroplattenassay ist leicht anpassbar an die Tätigkeit jedes Gerinnungsfaktor messen. Dieser Assay wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinischen Umgebungen zu erhöhen. Diese Informationen werden positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Gerinnungsstörungen, wie DIC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kinetische Mikroplatte Assayverfahren skizziert die Entwicklung eines neuartigen, schnelle, kostengünstige und praktische Technik zur Messung von FV Gerinnungsaktivität in Proben von humanem Plasma, das kein (FV 1-Stufen-Test) oder wurden absichtlich mit zugesetzten Thrombin (FV aktiviert 2-Stufen-Test). Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser und alle Materialien und Reagenzien erforderlich sind kommerziell erhältlich oder können in-house erfolgen. Der Assay überwacht ständig die Änderung in der Lichtstreuung von Plasma während Fibringerinnsels Formation bei 405nm. Die Mikroplattenassay hat den Vorteil, mit kleinen Plasma Probenvolumina (ul) und ist zugänglich für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig (bis zu 12). Diese Attribute sind Assay vorteilhaft, wenn teure Geräte und Reagenzien verwendet werden (automatische Analysegeräte und Faktor-defizienten Plasmen), nur kleinen Probenvolumina zur Verfügung (Patientenplasmen) oder Analysieren einer großen Anzahl von Proben (Während FV Aufreinigung from Plasma).
Die FV Mikroplattenassay hat die zusätzlichen Vorteile, dass es bequem, schnell ist, und erfordert nicht die Isolierung und Reinigung der benötigten Bestandteile. Verglichen mit manueller Dreh-Rohr 3, 4 und automatisierte 5-7 FV-Assays, die gemeldet wurden, hat der FV Mikroplattenassay vergleichbaren Reihe von nützlichen Gerinnungszeiten (25-75 sec) und der entsprechenden FV Ebenen in der Probe (0,5 bis 0,005 Einheiten / ml), und die Empfindlichkeit / Nachweisgrenzen (20-80pM). Im Vergleich zum manuellen Kipp-Rohr FV Assays, die aus einer subjektiven visuellen Beurteilung der Gerinnselbildung 3, 4 leiden erlaubt der FV Mikroplattenassay objektive und quantitative Messung der Gerinnungszeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Verglichen mit automatisierten FV Assays, die von der Pflicht zur teure Analysegeräte und Reagenzien 7.5 leiden, sind die FV Mikroplattenassay Reagenzien und Materialien kostengünstig und alle benötigten Materialien können purcha seinsed kommerziell oder aus in-house. Manuelle Kipp-Rohr 3, 4 und 5-7 automatisierten Assays FV Allgemeinen nur den Zeit bis zur Gerinnselbildung; nicht die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung, die alle genau spektrophotometrisch mit der Mikroplatte FV-Assay gemessen. Schließlich leiden manuellen Tilt-Rohrs 3,4 und automatisierte 5-7 FV Assays ab nur in der Lage, das FV-Aktivität in Plasmaproben ein zu einer Zeit zu messen, während die FV Mikroplattenassay zugänglich ist, um mit hohem Durchsatz und 12 Proben können Assay gleichzeitig.
Die Mikrotiterplatte wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass die in 9 FV DIC Patientenplasmen weniger aktiv als in NHP aufgrund einer Kombination von verzögerten Gerinnungszeiten und unteren Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung in der FV 1-Stufen-Test war. Die ersten Preise der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay in den DIC Patientenplasmen wurden nicht von NHP geändert. Die Ausmaße der Gerinnselbildung in der DIC patient Plasmen wurden auch nicht von NHP in der FV 1-stufig und 2-stufiger Assays geändert. Verminderte FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Aktivitäten können schon aufgrund der erhöhten FV Verbrauch 19 und / oder Inaktivierung 6 in Übereinstimmung mit anderen Studien, die während der Pathogenese dieser erworbenen Erkrankung des Blutes haben. Angesichts des Umfangs der Gerinnselbildung in den Plasmen DIC war das gleiche wie mit NHP beobachtet, war diese Variable wahrscheinlich eine Folge der Konzentration an Fibrinogen in der FV-Mangelplasma und nicht auf die Eigenschaften der Patientenplasmen verwandt.
Die Ergebnisse aus der Mikroplatten-Assay zeigte, dass die Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma kann aus der Zeit und Anfangsgeschwindigkeit der Gerinnselbildung vom FV 1-Stufen-Test und dem Zeitpunkt der Gerinnselbildung und Gesamtaktivität von der FV 2 erhalten werden – Bühne Assay. Es war nicht möglich, quantitative Messung der FV-Aktivität in einer Plasmaprobe erhalten bezogen auf das Ausmaß der Bildung von Blutgerinnseln in tEr FV 1 – und 2-stufiger Assays oder die anfängliche Geschwindigkeit der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay. Angesichts alle Reaktionen erreicht etwa den gleichen Umfang der Gerinnselbildung von 0,35 bis 0,45 Einheiten zwischen den Anfangs-Absorption vor und nach der maximalen Absorption Thromboplastin und Calciumchlorid hinaus bedeutet die Messung des Ausmaßes der Gerinnselbildung keine quantitative Beurteilung der FV-Aktivität in einem gegeben Plasmaprobe.
Das neuartige Mikroplattenassay finden Einsatz in Forschung und klinischen Einrichtungen zur Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma und Fraktionen während dessen Reinigung aus menschlichen und tierischen Plasmas. Die Mikroplatte Assay verwendet werden, um die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß der Gerinnselbildung zu messen; Parametern allgemeinen nicht gleichzeitig im manuellen Plane-Rohr Assays und automatisierte Gerinnungsmeßgeräte überwacht. Mit diesen Informationen kann eine vollständige quantitative Bewertung der Beteiligung der FV während der Gerinnselbildung Eventin humanem Plasma als bisher 3-7 berichtet. Diese Information ist besonders wichtig in Forschung und klinische Labors beim Messen signifikanten Veränderungen FV-Aktivität in Proben von Plasma oder mit gereinigten FV oder FVa. Die FV Mikroplatte Assay kann auch verwendet werden, zu charakterisieren und zu messen, die Verbindungen zu aktivieren oder zu inaktivieren, FV und FVa können, messen die FV Aktivität bei Patienten mit einem Risiko für venöse Thrombose als Folge des FV-Leiden-Mutation 20, 21 und um die Aktivität zu überwachen FV während seiner Reinigung aus Plasma.
Die FV Mikroplattenassay leicht anpassbar ist, um die Aktivität von jedem Gerinnungsfaktor im extrinsischen, intrinsische oder gemeinsamen Pfad zu messen unter Verwendung der entsprechenden Faktor-Mangelplasma und Initiieren Reagenzien zur Fibrinbildung. Der Test wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinische Labors zu erhöhen. Letztely, werden diese Informationen positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Menschen mit Gerinnungsstörungen, wie DIC heimgesucht.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Untersuchung wurde mit Professional Development und Forschung Startup Funds von der University of Ontario Institute of Technology (UOIT) an Dr. John A. Samis und kanadischen Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award an Irina Levit unterstützt. Die Autoren danken Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) für ihre Unterstützung der Vorbereitung des Videos. Die Autoren danken Dr. Michael E. Nesheim (Department of Biochemistry, Universität der Königin, Kingston, ON) für seine Betreuung, Einsicht und hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Haemostasis and Thrombosis Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) für die Bereitstellung der DIC Patientenplasmen in der Studie verwendet.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
Referências
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