La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

A. cromatina inmunoprecipitación (CHIP) (ver Figura 1) 1. El entrecruzamiento doble de la cromatina determinada proteínas y la recolección de células (A 02:10 del vídeo) Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es el primer paso crítico que participan en la construcción de una biblioteca CHIA-PET. Este paso es importante para reducir el nivel de ruido de fondo complejidad, y añadir la especificidad. La preparación de chip tendrá que ser optimizado para el tipo de células y el factor de interés. Este protocolo se basa en la RNA polimerasa II CHIA-PET biblioteca preparada a partir de células MCF-7 9 construidos en nuestro laboratorio. Para asegurarse de que la biblioteca resultante es de una complejidad suficiente, recomendamos el uso de 1 x 10 8 células para preparar el material de chip. Dependiendo de la línea de destino y la célula, el rendimiento obtenido puede estar entre 100 ng a 300 ng. Se recomienda que un mínimo de 100 ng chip se debe utilizar para construcc una biblioteca CHIA-PET con menos de 20 ciclos de PCR para minimizar la redundancia en la secuencia. Cantidades más altas de material de chip permitirá una mayor reducción de redundancia, la mejora de la calidad de las bibliotecas. Lavar 1 x 10 8 células MCF-7 (equivalente a cinco 500 cm 2 placas cuadradas de 2 x 10 7 células) dos veces con tampón fosfato salino (PBS) pre-calentado a 37 ° C. Reticulación células MCF-7 con 1,5 mM recién preparada etilglicol bis (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) durante 45 minutos a temperatura ambiente (22 ° C) con la rotación en una campana química. Añadir 37% de formaldehído a una concentración final de 1% durante 20 minutos a temperatura ambiente (22 ° C) con la rotación en una campana química. Quench los reticulantes mediante la adición de 2 M de glicina a una concentración final de 200 mM. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente(22 ° C) con la rotación. Desechar reticulantes enfriadas en un matraz de residuos y lavar las células dos veces con PBS frío. Deseche PBS y las células de la cosecha raspando. Mantenga las células recolectadas en el hielo. Lavar la placa con 5 ml de PBS (con inhibidores de la proteasa ("+ IP") que se añade, según las instrucciones del fabricante) para maximizar la recolección de las células. Sedimentar las células a 1.800 xg (3.000 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y proceder a la lisis celular. Por otra parte, almacenar el pellet a -80 ° C. 2. Lisis de la célula (A 04:15 del vídeo) Resuspender el pellet en 15 ml de 0,1% tampón de lisis SDS (HEPES 50 mM pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-100, 0,1% desoxicolato de sodio, SDS al 0,1% + PI) a fondo por pipeteado. Girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellet lisaron las células de 800 xg (2.000 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y repetir la lisis celular, una vez como en el paso 2.1 y 2.2. El aislado sedimento nuclear está listo para la lisis nuclear. Por otra parte, almacén de pellets a -80 ° C. 3. Lisis Nuclear (A las 05:00 de la video) Lisis nuclear se realiza para liberar la cromatina reticulado antes de la fragmentación de la cromatina. En ausencia de membrana nuclear, la cromatina reticulada puede sonicó usando suaves condiciones. A veces, la fuerza sonicación puede no ser suficiente para romper la membrana nuclear, en cuyo caso, menos de la cromatina se obtiene porque los núcleos intactos serán desechados después de la centrifugación. Sin embargo, los diferentes tipos de células pueden requerir diferentes condiciones. Resuspender aislado núcleos precipitado en 15 ml de SDS al 1% de tampón de lisis (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-100, de sodio 0,1% Deoxycholate, SDS al 1% + IP). Transferir a una suspensión de núcleos de alta velocidad centrífuga tubo (tubo de centrífuga de Oak Ridge (polipropileno)) y girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellets zadas núcleos de pellets en 47.810 xg (20.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Decantar sobrenadante y pellet ruptura con una punta de pipeta P1000. Lavar precipitado con 30 ml de 0,1% del buffer de lisis SDS (+ PI). Girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellet de la cromatina en 47.810 xg (20.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y repetir lavar una vez como en el paso 3,4 a 3,6 antes de proceder a la fragmentación de la cromatina. Por otra parte, la tienda de la cromatina pellet a -80 ° C. 4. La fragmentación de la cromatina (A las 07:03 de la video) Transferencia de la cromatina de pellets a un tubo de poliestireno ronda de 14 ml de prueba de fondo. Añadir 1 ml de SDS al 0,1% de tampón de lisis (+ PI) a la cromatina PEllet. Asegúrese de que no hay burbujas en la mezcla, ya que esto afecta la eficiencia de ultrasonidos. Cizallamiento cromatina-ADN a un tamaño de 200 a 600 pares de bases con un Branson digital Sonifer célula disruptor (amplitud 35%, 9 minutos (30 segundos en, 30 segundos off)) y mantener las muestras en frío en todo momento para evitar el sobrecalentamiento mediante la realización de la sonicación en una habitación fría (ver Figura 2). Inversa-reticular una alícuota de la cromatina y comprobar la eficiencia de fragmentación con los pasos siguientes. (Los pasos siguientes no se muestran en el vídeo). Alícuota de 10 l de cromatina después de la sonicación. Centrífuga sonicated cromatina en 16.110 xg (13.200 rpm) durante 5 minutos a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir 2 l de solución de proteinasa K. Incubar durante 30 minutos a 50 ° C. Resolver revertir reticulado de la cromatina en un 1,5% en gel de agarosa. REPITEt sonicación si los tamaños de ADN son más grandes que lo esperado. Centrifugar lisado restante a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C y la transferencia sonicó cromatina (sobrenadante) en un tubo nuevo antes preclearing con perlas magnéticas. Por otra parte, la tienda sonicated cromatina a -80 ° C hasta que la cromatina se recoge suficientes para iniciar un chip. 5. Lavado, Preclearing y revestimiento de anticuerpos de Cuentas (A las 08:17 de la video) Preclearing de la cromatina Utilice 300 l de perlas magnéticas de una proteína G IP. Lavar perlas tres veces con 5 ml perlas tampón de lavado (PBS, 0,1% de Triton X-100). Esto lavados y el futuro que implican magnéticos proteína G perlas constan de los siguientes pasos. Asegúrese de perlas magnéticas no se sequen. Recuperar cuentas mediante un concentrador de partículas magnéticas. Discard sobrenadante. Resuspender perlas con tampón. Girar durante 5 minutos a 4 ° C. Se centrifuga a 129 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recuperar cuentas mediante un concentrador de partículas magnéticas. Desechar el sobrenadante. Combine la cromatina sonicado con cuentas prelavadas, para eliminar la unión de fondo de la cromatina a los granos. Mantenga 10 l de la cromatina sonicado como "de entrada" para comprobar el enriquecimiento posterior de la PCR cuantitativa (qPCR). Almacenar a 4 ° C. Gire la noche a 4 ° C. Centrífuga sonicated cromatina en 129 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Colocar el tubo en el concentrador de partículas magnéticas. Recubrimiento de anticuerpos a perlas magnéticas Alícuota 300 l de perlas magnéticas proteína G a un tubo nuevo. Lavar perlas tres veces con tampón de lavado 5ml perlas (PBS, 0,1% de Triton X-100). Añadir un volumen equivalente (en el paso 5.1.3) de tampón de lavado perlas. Añadir 35 g de RNA polimerasa II (8WG16) anticuerpo monoclonal. Gire la noche a 4 ° C. Lavar perlas recubiertas de anticuerpos dos veces con 5 ml de tampón de lavado perlas. Reclaim anticuerpo perlas recubiertas utilizando un concentrador de partículas magnéticas. 6. Inmunoprecipitación de la cromatina (A las 10:03 de la video) Para reducir el nivel de complejidad y el ruido de fondo, los anticuerpos contra factores específicos de la proteína se utilizan para enriquecer fragmentos específicos cromatina de interés antes de la ligadura de proximidad 6. En este caso, hemos utilizado un ratón ARN polimerasa II monoclonalanticuerpo (8WG16) que reconoce el formulario de iniciación de la proteína. Por fragmentos de ADN enriquecedoras que están asociados con la RNA polimerasa II, la especificidad de la biblioteca se puede aumentar, lo que permite la identificación de las interacciones cromatina de largo alcance entre promotores activos y sus regiones reguladoras correspondientes 9. Desechar el tampón de lavado de anticuerpos perlas recubiertas con la ayuda de un concentrador de partículas magnéticas. Transferencia sonicó cromatina (sobrenadante del paso 5.1.6) con la ayuda del concentrador de partículas magnéticas para perlas recubiertas con anticuerpo (del paso 5.2.7). Gire la noche a 4 ° C. 7. Lavado y elución de inmunoprecipitadas ADN-proteína Complejos (A las 11:13 de la video) Lave la cromatina immunoprecipitated cuentas tres veces con 5 ml de 0,1% tampón de lisis SDS. Lavar perlas una vez con 5 ml de tampón de lavado de alta sal (50 mM, pH 7,5 HEPES, 350 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desoxicolato sódico al 0,1%, 0,1% de SDS). Lavar perlas una vez con 5 ml de tampón de lavado de litio cloruro (10 mM Tris pH 8,0, 250 mM de LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% de Nonidet P-40, desoxicolato sódico al 0,5%). Desechar el tampón de lavado y volver a suspender las perlas lavadas con 1 ml de tampón TE. Girar durante 5 minutos a 4 ° C. La muestra está lista para la cuantificación y verificación enriquecimiento chip. Una vez que el material suficiente chip que se ha recogido, la muestra está listo para ser construido en una biblioteca de Chia-PET. Este paso es fundamental, y debe hacerse para garantizar el éxito de Chia-PET construcción de la biblioteca. Enriquecidos con chip-perlas se pueden almacenar hasta por 2 semanas a 4 ° C mientras se somete a la cuantificación, el control de chip de enriquecimiento, y la acumulación de material suficiente. Eluir y reverso-entrecruzamiento "de entrada" del ADN y los granos enriquecidos con chip-con los pasos siguientes. (Los pasos siguientes no se muestran en el video.) Eluir 20% de enriquecidos chip-perlas con 200 l tampón de elución chip (50 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% de SDS). Girar durante 30 minutos a 37 ° C. Centrifugar cuentas eluidas a 6.100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Traslado eluidas complejos chip (sobrenadante) a un nuevo tubo con la ayuda del concentrador de partículas magnéticas. Inversa-reticulación "entrada" y eluida complejos chip con 2 l de proteinasa K (concentración final de 0,2 g / ml) durante 2 horas a 50 ° C. Transferencia inversa reticulado "entrada" del ADN y de chips de ADN eluido en un 2 ml de alta densidad MaXtract (respectivamente). Añadir 200 l 25:24:1 fenol-cloroformo-isoamílico alcohol pH 7,9 a los tubos en una campana para vapores químicos e invierta para mezclar bien. Derivado de los tubos durante 5 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo y precipitar invertir ingenio reticulado ADNh 20 l de sodio 3 M de acetato de pH 5,5, 200 l de isopropanol y 1 l de 15 mg / ml Glycoblue. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos y el ADN precipitado durante 30 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a 4 ° C. Después de la centrifugación de ADN precipitado isopropanol, lavar ADN precipitado con etanol helado 75% dos veces y resuspende el precipitado de ADN en 20 l de tampón TE. Cuantificar "entrada" de ADN (del paso 5.1.3) y chips de ADN por el ensayo de PicoGreen 10. Realizar una comprobación de enriquecimiento a través de PCR cualitativa (qPCR). B. Análisis de Interacción con la cromatina emparejado-extremo de la etiqueta de secuenciación (Chia-PET) La segunda mitad del video hará hincapié en los pasos clave en la construcción de una biblioteca CHIA-PET. 1. Fin embotamiento de fragmentos de ADN chip En este capítulo del vídeo pone de relieve dos main puntos, un procedimiento paso a paso de lavado de partículas magnéticas para eliminar las enzimas y el almacenamiento en búfer de sal de la reacción anterior (Paso 1.1, 12:22-12:54 del vídeo) y el procedimiento de la creación de reacciones enzimáticas que involucran partículas magnéticas en la mezcla de reacción (Paso 1,2, 12:54-13:25 de vídeo). Lave enriquecidos chip-cuentas, una vez con helado de buffer TE. Esto lavados y el futuro que implican perlas magnéticas constan de los siguientes pasos. Centrifugar a 6100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recuperar cuentas mediante un concentrador de partículas magnéticas. Desechar el sobrenadante. Añadir tampón de cuentas. Mezcla perlas con tampón con un movimiento rápido de acción. Centrifugar a 6100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recuperar cuentas mediante un concentrador de partículas magnéticas. Desechar el sobrenadante. Para llenar-en sonicado overhaNGS, preparar una mezcla maestra con 70 l Tampón x 10 para la polimerasa de ADN de T4, 7 l 10 mM dNTPs y 615,8 l de agua libre de nucleasa. Mezclar bien y resuspender perlas lavadas con el maestro-mix. Añadir 7,2 l 9,7 U / l de polimerasa de ADN de T4 a un volumen final de 700 l. Mezclar e incubar durante 40 minutos a 37 ° C con rotación (con Palico Biotech Intelli-mezcladora RM-2L, F8, 30 rpm, U = 50, U = 60). Realizar todas las reacciones enzimáticas posteriores con los pasos siguientes. Diluir tampones de reacción con agua libre de nucleasa. Añadir todos los demás reactivos (excepto las enzimas) para la solución diluida. Mezclar bien. Volver a suspender cuentas o pellets con la mezcla de reacción. Añadir la enzima a los granos volvieron a suspender o pellets (Mantenga las enzimas en la caja de sobremesa más fresco en todo momento para garantizar la máxima actividad enzimática). Cierre el tubo con parafilm. Asegúrese de que las cuentas están bien mezclados en todo el incubatio todan. Desechar mezcla de reacción y lavar las sales residuales de amortiguamiento y enzimas tres veces con tampón de lavado enfriado con hielo (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM de NaCl). 2. La ligadura de Biotinylated Half-enlazadores de chips de ADN Este capítulo del vídeo destaca las características de los oligonucleótidos medio-enlazador utilizados en la construcción de Chia-PET y el uso de la composición de nucleótidos de código de barras para distinguir entre productos de ligación no específica y específica (13:28-14:24) del de vídeo). El capítulo también muestra el procedimiento paso a paso de crear una reacción de ligación medio enlazador (Paso 2.2, 14:24-15:54 del vídeo). Hay dos tipos de biotina medias enlazadores se introducen en este protocolo y se han diseñado con un código de barras interno de cuatro nucleótidos (TAAG o ATGT) y un sitio de reconocimiento para el tipo de enzima de restricción MmeI IIS (TCCAAC). Después de chip enriquecerción, se sonicó fragmentos de cromatina se dividen por igual en dos partes alícuotas y se ligó primero con un exceso de cualquiera de media-enlazador A o medio enlazador-B 5,9. Divida enriquecidos chip-cuentas en dos alícuotas de ADN de medio enlazador ligadura de biotina medias conectores A o la mitad de los conectores B, respectivamente. Estos dos medios conectores tienen las mismas secuencias de nucleótidos, a excepción de cuatro nucleótidos en el medio que sirven (Half-enlazador A con TAAG, la mitad de engarce B con ATGT) como códigos de barras de nucleótidos. Cuando se combinan durante la ligadura de proximidad, al azar y la ligadura no específica entre dos conjuntos de chip diferentes pueden ser identificadas de la población de las secuencias con engarces heterodímero AB, en comparación con la ligadura específicas que pueden ser identificados a partir de la población de las secuencias con el homodímero AA o BB enlazadores . Ligar chip-enriquecidos con perlas de 140 l de 5 x tampón de T4 ADN ligasa con PEG, 3,5 l de 200 ng / l biotinilados enlazadores medias A o B, 553,5 l de nucleasaagua libre y 3 l 30 U / l de ADN ligasa T4 (Mantenga ADN ligasa de T4 en una nevera portátil de sobremesa en todo momento como ligasas son inestables, incluso en el hielo). Sellar el tubo con parafilm y se incuba durante una noche a 16 ° C con rotación. 3. Elución y la Ligadura de proximidad de los fragmentos de chips de ADN En este capítulo del video explica el papel de tampón EB, SDS y Triton X-100 durante la elución de los complejos de la cromatina de cuentas y también se muestra el procedimiento paso a paso de crear una reacción circularización (Paso 3.9, a la 15:54 17:10 del vídeo). Después de ligar los enlazadores medio de los fragmentos de cromatina, ambas fracciones se combinan y se eluyó de las perlas. Interacción fragmentos de ADN a continuación estarán conectados por una secuencia de unión completa durante la ligadura de proximidad. Uso de la composición de nucleótidos de código de barras, las secuencias pueden ser clasificados en tres categorías, a saber, las secuencias de wiº heterodímero AB enlazadores (código de barras ATGT / TAAG) y secuencias con homodímero AA o BB (conectores de código de barras TAAG / TAAG o ATGT / ATGT) para distinguir productos de la unión no específicos y específicos, respectivamente 9. Por lo tanto, el uso de dos medias enlazadores con diferentes códigos de barras de nucleótidos permite la especificación de diferentes experimentos o repeticiones, así como la monitorización de la tasa no específica ligadura quimérico entre complejos chip diferente 5. Lavar medio-enlazador-ligados perlas tres veces con tampón de lavado enfriado con hielo (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM de NaCl). Combinar los dos tubos de medio-enlazador-ligados perlas de la siguiente manera. Reclaim uno de los tubos de media-enlazador-ligados perlas utilizando un concentrador de partículas magnéticas ("tubo A"). Mantenga el otro tubo de la mitad de engarce con ligadura cuentas sobre hielo ("tubo B"). Deseche el tampón de lavado (desde el paso 3.2.1) fUn tubo de rom y transferir la mitad de engarce con ligadura bolas (desde el paso 3.2.2) del tubo B en un tubo., mientras que un tubo todavía está en el colector de partículas magnéticas Añadir 700 l helado de tampón de lavado a B de metro para recoger los residuos de media enlazador ligados cuentas y asegurar los dos tubos de medio-enlazador-ligados cuentas se combinan adecuadamente. Transferir la solución de lavado en el tubo A. Eliminar el vacío del tubo B. Fosforilan medio enlazador ligados cuentas con 70 l de 10 x tampón de T4 ADN ligasa (NEB), 616 l de agua libre de nucleasa y 14 l U 10 / l de polinucleótido quinasa de T4 ADN. Incubar durante 50 minutos a 37 ° C con rotación. Reclaim fosforilados medio enlazador ligados cuentas mediante un concentrador de partículas magnéticas y desechar la mezcla de reacción. Eluir medio-enlazador-ligado cromatina-DNA complejo con 200 l tampón de elución recién preparada (tampón TE, 1% de SDS). Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (22 °C) con la rotación. Transferir eluato a un tubo nuevo y enjuague perlas con 900 l tampón EB. Transferir el sobrenadante al mismo tubo de combinar las eluciones. Transferir eluato recogido a las copas de filtro de dos filtros de centrífuga de tubo y centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 1 minuto a temperatura ambiente (22 ° C). Secuestrar SDS mediante la adición de 90 l 20% de Triton X-100 e invierta para mezclar bien. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. Circularización se realiza bajo condiciones extremadamente diluidas con el fin de favorecer la ligadura de eventos dentro de las distintas cromatina complejos entrecruzados y reducir al mínimo la ligadura de eventos entre los complejos de la cromatina diferentes que dan lugar a moléculas de ADN quimérico indeseables. Trabajo sobre hielo, transferir eluato templado a un tubo Falcon de 50 ml y añadir 7776 l agua libre de nucleasa, 1000 l de 10 x tampón de ligasa de ADN T4 (NEB) y 33,33 l 30 U / l ADN ligasa de T4. Incubar durante una noche a 16° C. 4. Inversa-reticulación y purificación de ADN En este capítulo del vídeo muestra el procedimiento paso a paso de fenol: cloroformo extracción (4.3 Paso, 17:11-17:59) y la cerca-del ADN granulado después de la centrifugación en el Paso 4.4. Inversa-reticulación y degradación de proteínas mediante la adición de 100 l de 20 mg / ml de solución de proteinasa K. Incubar durante 2 horas a 50 ° C. La transferencia de ADN de la cromatina en un 50 ml de alta densidad MaXtract y añadir 9ml libre de nucleasa agua para obtener un volumen final de 19 ml. Añadir 19 ml 25:24:1 fenol-cloroformo-isoamílico alcohol pH 7,9 con el tubo en una campana para vapores químicos e invierta para mezclar bien. Derivado de los tubos durante 5 minutos a 1.800 xg (3.000 rpm) a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa superior a un Tubos de centrífuga de 50 ml de Oak Ridge (Teflón FEP) y el ADN precipitado cromatina con 1,9 ml de pH 3 M de acetato de sodio 5,5, 19 ml isopropanol y 5 Glycoblue l. Glycoblue se añade para mejorar la visibilidad de la pastilla. Incubar a -80 ° C durante al menos una hora. Deje que la solución congelada se descongele antes de centrifugar a 38.720 xg (18.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación de ADN precipitado isopropanol, lavar ADN precipitado con etanol helado 75% dos veces y resuspende el precipitado de ADN en 34 EB Tampón l. Transferir mezcla de ADN a un tubo LoBind 1,7 ml de ADN. Resuspender el precipitado de ADN en 34 l del buffer EB. (Tratamiento con RNasa es opcional posterior lavado y purificación en el protocolo de Chia-PET sirven para eliminar la contaminación de ARN y las inspecciones manuales de las secuencias de Chia-PET de nuestros internos bibliotecas han mostrado rastros de contaminación de ARN). Lleve a cabo la digestión RNasa mediante la adición de 10 l de RNasa ONE 10 x tampón de reacción, 55 l de agua libre de nucleasa y 1 l de 10 U / l ribonucleasa RNasa ONE. Incubar a 37° C durante una hora. La transferencia de ADN de la cromatina en un 2 ml de alta densidad MaXtract. Añadir 100 l 25:24:1 fenol-cloroformo-isoamílico alcohol pH 7,9 con el tubo en una campana para vapores químicos e invierta para mezclar bien. Girar el tubo durante 5 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a temperatura ambiente (22 ° C). Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo y precipitado inversa reticulado ADN con 10 l de pH 3 M de acetato sódico 5,5 y 100 l de isopropanol. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos y el ADN precipitado durante 30 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a 4 ° C. Después de la centrifugación de ADN precipitado isopropanol, lavar el sedimento de ADN con etanol helado 75% dos veces y resuspende el precipitado de ADN en 34 EB Tampón l. 5. La inmovilización de Chia-PET de ADN para perlas estreptavidina La introducción de este capítulo habla sobre la presenciadel sitio de reconocimiento MmeI y la T biotinilado presentes en los oligonucleótidos medio-enlazador para facilitar la extracción de las construcciones de etiqueta-tag-enlazador ("PET", 18:02-19:10 del vídeo). Además, este capítulo del vídeo también se da una rápida visión de la etapa 5.2, el procedimiento paso a paso de crear una reacción de PCR (Paso 6.1, 19:10-20:00 del vídeo) y la eliminación de un éxito CHIA-PET de ADN (Paso 6.9 de 20:00 a 20:30). La mitad de los conectores A y B contienen los sitios que flanquean MmeI reconocimiento, permitiendo que este tipo de enzima de restricción para cortar IIS 18/20 pares de bases aguas abajo de sus sitios de unión a la diana para generar cortos "tags" del fragmento de la cromatina, la producción de pares de etiquetas de marcas de enlazador de construcciones ("PET"). Para permitir la purificación de las construcciones de PET por estreptavidina-perlas magnéticas recubiertas, tanto medio-enlazador A y B están modificados con biotina, permitiendo la captura y purificación de los constructos CHIA-PET. C lanzamientoaptured CHIA-PET de ADN mediante la adición de 5 ml de 10 x NEBuffer 4, 5 l recién preparada de 500 micras (10 x) S-adenosilmetionina (SAM) y 1 l 2 U / l MmeI al ADN resuspendido. Quench MmeI exceso mediante la adición de 5 ml no biotinilados medias enlazadores a la mezcla de reacción para MmeI puede ser auto-inhibitorio en exceso. Incubar durante 2 horas a 37 ° C. Para capturar liberados CHIA-PET de ADN, 50 l de transferencia de resuspensión de M-280 perlas de estreptavidina a un tubo de LoBind ADN. Lavar dos veces con perlas de 2 x tampón de unión y de lavado (2 x B & W: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M). Volver a suspender las cuentas de cada 50 l 2 x B & W de búfer y transferir 50 l de mezcla de la digestión (desde el paso 5.1) para el mismo tubo. Mezclar bien e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente con rotación. Recuperar cuentas con un concentrador de partículas magnéticas y desechar el sobrenadante. Lavar dos veces con perlas de 150 ul x 1 de unión y de Tampón de Lavado (1 x B & W: 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, NaCl 1 M). <liligar> 454 GS20 Adaptadores a Chia-PET ADN con 5 l de 10 x tampón de ligasa T4 ADN (Nótese que el tampón de ligasa utilizado en esta etapa es diferente de paso 3,9, el tampón de ligasa utilizado en esta etapa es de la misma compañía que el que suministra la ligasa T4 ADN), 4 l de 200 ng / l 454 GS20 adaptador A, 4 l de 200 ng / l 454 GS20 B adaptador, 36 l de agua libre de nucleasa y 1 l de 30 U / l ADN ligasa de T4. Incubar durante una noche a 16 ° C con rotación. CHIA-PET de ADN también se pueden ligar con Illumina-NN adaptadores, en cuyo caso se recomienda la amplificación de la biblioteca mediante PCR primer PE1.0 y PCR primer PE 2.0 comprado de Illumina. Recuperar cuentas con un concentrador de partículas magnéticas y desechar el sobrenadante. Lávese las cuentas de tres veces con 150 l 1 x B & W Buffer. Nick traducir CHIA-PET de ADN con 5 ml de 10 x NEBuffer 2, 2,5 l de 10 mM dNTPs, 38,5 l de agua libre de nucleasa y 4 l 10 U / l Escherichia coli DNA polimerasa I. Se incuba durante la noche aa temperatura ambiente (22 ° C) con la rotación. Recuperar cuentas con un concentrador de partículas magnéticas y desechar el sobrenadante. Lávese las cuentas de tres veces con 150 l 1 x B & W Buffer. Resuspender perlas con 50 EB Tampón l. 6. La amplificación de Chia-PET de ADN Establecer las reacciones de PCR con dos cuentas de suspensión de l, 21 l de agua libre de nucleasa, 1 l de 10 mM de Illumina 1-454 de imprimación, 1 l 10 mM Illumina 2-454 de imprimación y 25 Phusion l de alta fidelidad Mix Master. Para determinar el número de ciclos necesarios para generar suficientes productos de PCR para la secuenciación, estableció tres pruebas las reacciones de PCR con los ciclos 16, 18 y 20. No exceder de 20 ciclos, como se ha encontrado que los resultados haciendo así de la complejidad de biblioteca muy bajo. Paso inicial 30 segundos 98 ° C (Desnaturalización) 18 a 25 ciclos 10 segundos 98 ° C (Desnaturalización) 30 segundos 65 ° C (Recocido) 30 segundos 72 ° C (Ampliación) Paso Final 5 minutos 72 ° C (Extensión final) Determinar el número de ciclo más bajo posible mediante la ejecución de las reacciones de PCR sobre un gel de gradiente 4-20% de TBE y tinción con SYBR Green I, asegurando la presencia de una banda de 223 pares de bases, que es la longitud del ADN CHIA-PET. Amplificar el resto de las perlas de estreptavidina-CHIA PET ADN enlazados en una PCR a gran escala con tan pocos ciclos de PCR como sea posible mientras que todavía obtener rendimiento suficiente para la secuenciación. Recuentas de reclamación de todas las reacciones de PCR utilizando un concentrador de partículas magnéticas y la piscina sobrenadante a dos tubos nuevos de ADN LoBind. Precipitar cada tubo de sobrenadante mediante la adición de 60 l de acetato sódico 3 M, 2 l GlycoBlue y 600 l de isopropanol a reacciones agrupados. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos. Centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación de ADN isopropanol precipitado, lavar el ADN precipitado con etanol helado 75% dos veces y resuspende el ADN precipitado en 100 l de tampón TE y 5 l 6 colorante de carga x. Distribuir productos de PCR uniformemente en los pocillos de un gel de TBE 6%. Ejecute el gel en 1 x tampón de TBE a 200 V durante 35 minutos y se tiñen con SYBR Green I. Visualizar el gel con un transiluminador Reader oscuro. Cuidado especial el 223 pb banda del gel y realizar "agolpamiento gel de" ADN protocolo de extracción como sigue: Coloque extirpados fragmentos de gel en 0,6 ml MicroCtubos entrifuge que han sido perforados en la parte inferior con una aguja 21-G. Coloque cada tubo dentro de un tubo de 1,5 ml de tapón de rosca y se centrifuga a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 5 minutos a 4 ° C. Añadir 200 l de TE pH 8,0 a cada tubo y asegurar que las piezas de gel se sumerge por completo en el búfer. Congelar a -80 ° C durante una hora y se incuba a 37 ° C durante la noche. Transferir piezas de gel junto con el tampón en cada tubo a la taza de filtro de un filtro de tubo de centrífuga y se centrifuga a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Enjuagar cada tubo de 1,5 ml con 200 l de pH 8,0 y tampón TE tampón de transferencia de enjuague en cada unidad de filtro sobre la terminación de la primera vuelta. Filtro de la piscina a través y precipitado con isopropanol. Resuspender el precipitado de ADN con 15 l de buffer TE. 7. Compruebe la calidad und amplificación de Chia-PET de ADN Proceda con control de calidad utilizando el ADN de Agilent 1000 o Ensayo de análisis de ADN de Agilent de alta sensibilidad de Agilent Bioanalyzer 2100. El electroferograma de la prueba de ADN de Agilent debe mostrar sólo un pico, junto con una línea de base plana antes de proceder a Illumina Genoma Analizador IIx secuenciación. Antes de Illumina Genoma Analizador IIx secuenciación, Chia-PET ADN idealmente debe tener una concentración mínima de 10 nM. Realice una de 4 puntos de PCR cuantitativa de acuerdo a Illumina Guía de Protocolo de qPCR cuantificación para determinar la cantidad de muestra a cargar en la celda de flujo. Alternativamente, realizar una un punto de PCR cuantitativa como sigue: Diluir la plantilla de control a 100 pM, PM 10 y PM 1. Como se describe en el Protocolo de Illumina Cuantificación qPCR, una plantilla de control se define como cualquier biblioteca preparada para la secuenciación en la plataforma Illumina y debe ser lo más similar posible en términos detamaño de la plantilla, el contenido de GC y el tipo de biblioteca. Diluir el ADN CHIA-PET a 10 pm. Establecer PCR triplica cada dilución con 0,1 l Primer qPCR 1,1, 0,1 l Primer qPCR 2,1, 5 l LightCycler480 ADN SYBR Green I Master Mix, 3,8 l de agua libre de nucleasa y 1 l de plantilla con Roche Ciencias Aplicadas LightCycler 480 en tiempo real Sistema de PCR. Incluye dos controles negativos con 1 ml de agua libre de nucleasa como plantilla. Desnaturalización inicial 95 ° C a 5 minutos de 4,8 ° C / s Amplificación 95 ° C 10 segundos 4.8 ° C / s 60 ° C 1 minuto 2,5 ° C / s 72 ° C 30 segundos 4.8 ° C/ S La curva de fusión 95 ° C 5 segundos 4.8 ° C / s 65 ° C 1 minuto 2,5 ° C / s 95 ° C 5 ° C por adquisiciones Enfriamiento 40 ° C 10 segundos 2,0 ° C / s Asegurarse de que los controles negativos no muestran ninguna amplificación y que la desviación estándar de los valores de Ct es inferior a 0,1 antes de calcular la concentración de las plantillas de biblioteca basado en la curva estándar generada a partir de las diluciones de control de la plantilla. Generar grupos en la superficie de las células de flujo de Illumina al cargar int 13:05o Illumina Cluster CBOT Sistema de generación de acuerdo a las instrucciones que aparecen en pantalla. Proceda a la secuencia de Chia-PET de ADN en el Analizador de Illumina Genoma IIx con Illumina 3-454 cebador de secuenciación y de iluminación 4-454 cebador de secuenciación en un solo carril para ver la calidad de la biblioteca. Guarde el resto CHIA-PET de ADN a -20 ° C. Si la biblioteca tiene buenos datos, preparar la muestra para carreras adicionales de 4 a 8 carriles como necesarios sobre la base de los resultados de la muestra de carril para obtener 18 hasta 20 millones Lecturas único. La cantidad de Chia-PET de ADN cargado en las celdas de flujo depende en gran medida en la versión del software de análisis de datos de secuenciación, secuenciación de Illumina, Estudio de control. Para la versión 2.9, los intervalos de concentración de carga de un tercio a la mitad de la capacidad máxima de cada pieza, lo que equivale a aproximadamente 21 millones filtrada de paso lee con aproximadamente 9,5 millones de lecturas de las PET. Reducción de carga es necesario para asegurar la correcta base llamada fo las secuencias de códigos de barras de los engarces. Este error se produce cuando un gran número de nucleótidos similares son secuenciados, como es el caso si el enlazador es secuenciado, para obtener información de código de barras. Si la información de código de barras no se desea, y los enlazadores no se leen, entonces la concentración de carga completa puede ser utilizado. Los archivos qSeq convertidos por la persona que llama línea de base pueden ser analizadas utilizando la herramienta de Chia-PET de acuerdo con el manual de la herramienta de instalación de Chia-PET (versión 4.1) 8. C. Representante CHIA-PET Resultados Hemos construido con éxito CHIA-PET bibliotecas utilizando ARN polimerasa II anticuerpo (8WG16) en células MCF-7 (CHM160 y CHM163) 9 usando 672 ng de material de chip como se describió anteriormente. El gel de diagnóstico inicial de ejecutar de esta biblioteca amplificado por PCR, como se mencionó en el paso 6.2 del protocolo de Chia-PET, que se muestra una banda brillante y bien definida en lael tamaño esperado de 223 pares de bases para todos los ciclos de PCR utilizado (ver Figura 4). 16 ciclos de PCR se utilizó para amplificar la biblioteca CHIA-PET y un rendimiento total de 17,1 ng obtenido se. Un solo pico, electroferograma intensa se ​​observó en el tamaño esperado de 223 pares de bases del ADN por medio de análisis de Agilent 1000 como se ha mencionado en el Paso 7,1 del protocolo CHIA-PET (ver Figura 5). Figura 1. Listado chip. Células MCF-7 son de doble reticulado con etilglicol bis (SuccinimidylSuccinate (BSA) y formaldehído secuencialmente, lo que resulta en enlaces covalentes entre cromatina espacialmente adyacente. La cromatina reticulada se obtuvo de las células MCF-7 fijos células por lisis celular y lisis nuclear. La cromatina se sometió a continuación a la fragmentación a un rango de tamaño de 200-600 pares de bases. Después de pre-limpieza de la cromatina sonicado con Protein G perlas magnéticas para eliminar los no específicos de ADN, la cromatina pre-aprobados se immunoprecipitated noche a la mañana con el anticuerpo revestida de piedras para capturar la cromatina de interés. Figura 2. Gel de análisis de los fragmentos de cromatina sonicadas. Una escalera 100 pb de ADN se muestra en el carril primera y última de referencia de tamaño. La cromatina sonicada muestra fuerte intensidad entre 200 y 600 pb, que es ideal para capturar interacciones de largo alcance de la cromatina. Figura 3. CHIA-PET general. Fragmentos de fragmentación de la cromatina son de extremo romo y se ligó a la biotina medias enlazadores que contienen sitios de restricción que flanquean MmeI. Complejos intactos cromatina se eluyen a continuación de las perlas y se sometió a ligación proximidad bajo condiciones extremadamente diluidas, tal que interactúan fragmentos de ADN son preferentially ligó a un otro. Después inversa de reticulación para eliminar asociados ADN-proteínas, la digestión se lleva a cabo MmeI para liberar etiqueta-tag-enlazador (PET) construcciones, que luego son purificados mediante la unión selectiva a perlas de estreptavidina. Las construcciones de PET se ligan con los adaptadores de secuenciación de alto rendimiento. Figura 4. Gel de análisis de Chia-PET después de la amplificación por PCR. Una escalera 25 pb de ADN se muestra en el carril 1 y 5 para referencia de tamaño. Las pistas 2 a 4 son los productos de PCR generados después de 16, 18 y 20 ciclos de amplificación por PCR de 2 l de plantilla talón-inmovilizado, respectivamente. Esta es una biblioteca de éxito, como se indica por las brillantes y bien definidas las bandas en el tamaño esperado de 223 pb. El frotis no específica se genera cuando el número de ciclos de PCR se incrementa mientras que la banda más baja de cada reacción de PCR se compone de dímeros de cebadores. <img src= "/ Files/ftp_upload/3770/3770fig5.jpg" alt = "Figura 5" /> Figura 5. Agilent 2100 Bioanalyzer análisis de purificado Illumina-454 adaptador ligado CHIA-PET. Captura de pantalla de Agilent 2100 Bioanalyzer electroferogramas perfiles de una biblioteca con éxito, con un solo pico intenso en el tamaño esperado de 223 pb. Tenga en cuenta que el Agilent Bioanalyzer ensayo general, informa un tamaño ligeramente superior a la esperada, en este caso, el pico deseado se muestra en 237 pb en lugar de 223 pb. Esto está dentro del rango de error 10% del ensayo de Agilent.